YAP蛋白在大腸新生物發生發展中的研究進展

呂俊衍，李春媚，魏云華，馬嵐青

(昆明醫科大學第一附屬醫院消化內科，昆明 650032)

我國是大腸癌高發國家，且發病率呈逐年上升趨勢。據2015年中國癌癥統計數據顯示，大腸癌的發病率和病死率居所有惡性腫瘤前5位，每年大腸癌新發病例37.6萬，死亡病例19.1萬，已成為嚴重危害我國國民健康的疾病之一[1]。研究發現，腺瘤性息肉是大腸癌的癌前疾病，約85%的大腸癌源于腺瘤性息肉[2]。目前，大多數學者認可的演變過程為正常腸上皮→過度增生上皮→大腸腺瘤→大腸癌，此過程與一系列原癌基因(Kras和C-myc等基因)或抑癌基因[VHL(Von Hippel-Lindau)、APC(adenomatous polyposis coli)、p53等基因]的改變有關[3-8]。上述基因的改變可導致大腸上皮細胞過度增殖、分化并發生異常凋亡改變等，逐漸向惡性增生進展。YAP(Yes-associated protein)蛋白進入細胞核定植后，可作為共轉錄因子與轉錄因子TEADs(TEA domain family members)結合，同時還能協同β聯蛋白，以激活與細胞增殖生長有關的原癌基因，并抑制凋亡相關基因，最終影響器官體積大小和腫瘤形成[9-11]。YAP蛋白作為致癌因子，可根據其在大腸腫瘤組織細胞內的表達水平判斷瘤樣新生物的良惡性程度，研究YAP蛋白高表達癌癥的靶點治療，進一步了解大腸癌的發病機制，為尋找有效的大腸癌治療方法開拓新的方向。現就YAP蛋白在大腸新生物發生、發展中的研究進展予以綜述。

1 YAP蛋白的結構與功能

YAP蛋白具有控制正常組織生長和維持器官體積大小的功能。YAP蛋白的功能首先在果蠅體內的YAP蛋白同源體Yki上發現，Yki位于果蠅hpo通路下游，作為共轉錄因子與TEAD/TEF家族轉錄因子Sd相結合，控制細胞凋亡抑制因子果蠅凋亡抑制蛋白1、細胞周期調節因子CycE等基因轉錄，以調控組織生長和維持器官體積大小，但其過表達則會使細胞增殖加強、凋亡減弱，導致腫瘤形成[12-14]。

Hpo通路及其靶因子Yki蛋白在進化中高度保守，在哺乳動物體內對應為Hippo通路和YAP蛋白，同時還存在結構與YAP蛋白相似、發揮類似功能的蛋白轉錄共激活因子PDZ結合基序[15-16]。YAP蛋白由人類染色體11q13上YAP基因編碼，分子量為65 000，富含無DNA結合結構域的脯氨酸Yes相關磷蛋白，其上第94位絲氨酸，即S94形成TEAD集合區，第172～204位和第231～263位氨基酸分別形成2個WW結構域、1個SH3結合基序、1個coiled-coil結構域、1個轉錄激活結構域以及C端的PDZ結合基序[16-17]。轉錄因子，如Runt家族成員多瘤病毒增強子結合蛋白2、p53蛋白家族成員p73、TEAD/TEF轉錄因子家族、Smads家族蛋白、T-box家族成員Tbx5、Runt相關轉錄因子家族成員Runx2、表皮生長因子受體家族成員第2表皮生長因子受體酪氨酸激酶4等均可與YAP蛋白的各類結構域結合[18]。

YAP蛋白的5個保守HXRXXS基序中的絲氨酸可被上游大腫瘤抑制基因1/2直接磷酸化，其中磷酸化后的絲氨酸127位可與蛋白14-3-3結合，磷酸化后的絲氨酸381位可促進酪蛋白激酶1δ/ε進一步磷酸化YAP蛋白的其他位點，YAP蛋白可在384位和387位依次被磷酸化后滯留于胞質，并招募泛素連接酶的組分β-轉導相容蛋白與其結合，引起YAP蛋白的多泛素化和降解，從而抑制YAP蛋白入核發揮功能[19-21]。胞質的YAP蛋白亦可通過WW結構域結合Smads家族蛋白，使其滯留于胞質而不能入核發揮轉錄因子作用，從而抑制轉化生長因子β信號通路的激活，而未被磷酸化的YAP蛋白則可入核結合并激活轉錄因子來發揮作用[22-24]。TEAD/TEF是發揮主要作用的轉錄因子，可調節結締組織生長因子、膠質瘤相關癌基因同源蛋白2、雙調蛋白、survivin基因以及許多其他蛋白的基因表達，使細胞呈現加速增殖或凋亡抑制的狀態。同時，激活的YAP蛋白和TEAD還能直接結合Lats2基因的啟動子，通過磷酸化YAP蛋白和抑制其活性，形成Hippo通路的負反饋[25]。

有研究表明，介導細胞接觸和連接的結構及復合物亦可協同作用Hippo通路[26]。如作為黏著連接成分用于連接細胞膜鈣黏素與細胞骨架actin蛋白的α聯蛋白可通過其PPXY基序或14-3-3蛋白的介導作用結合YAP蛋白并抑制其活性[26-28]。黏著分子血管生成抑制素結合蛋白(angiomotin，AMOT)家族可通過YAP蛋白的WW結構域和自身PPXY基序的相互作用招募YAP蛋白到胞膜緊密連接和actin蛋白處，通過相互結合使YAP蛋白定位在胞質，并激活大腫瘤抑制基因1/2，使YAP蛋白磷酸化，從而阻止其進入細胞核發揮促轉錄作用[29-31]。緊密連接蛋白2亦可通過PDZ結構域結合YAP蛋白將其阻滯在細胞核中，以發揮促進細胞凋亡的作用[32-33]。

2 YAP蛋白在腸上皮細胞更新及大腸腫瘤生成中的作用

YAP蛋白參與腸上皮細胞的發育過程，并發揮重要作用。研究發現，位于隱窩基底的干細胞首先遷移到腺腔內分化成瞬時擴增細胞，再分化成各種成熟的功能性細胞，并逐漸分布到絨毛中，進而遍布整個小腸表面[8]。內源性YAP蛋白多存在于腸道干細胞定居的腺窩區，在未分化的腸道細胞和干細胞中高表達，從隱窩基底部到上皮絨毛，其活性逐漸下降且出現核質異位[34-35]。腸道細胞YAP蛋白表達升高，腸道干細胞和祖細胞會增加，但多呈未分化狀態。有研究發現，YAP蛋白活化后第5天的小鼠腸道杯狀細胞和潘氏細胞缺失，隨后，人大腸癌標本中也發現了類似YAP蛋白誘導的腸道組織細胞的發育異常，表明YAP蛋白的激活可破壞腸上皮細胞的正常發育和分化[36]。

大腸息肉的發展和癌變常伴隨Kras、C-myc、β聯蛋白等原癌基因的激活[37-38]。激活的YAP蛋白可作為共轉錄因子參與Kras、β聯蛋白、蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路等原癌基因的啟動活化，故認為YAP蛋白是大腸癌的致癌因子[39-41]。有研究證實，鋸齒狀腺瘤、家族性結直腸腺瘤性息肉病患者的結腸管狀腺瘤和大腸癌組織中均存在YAP蛋白的異常增高和入核定植，但周邊正常上皮組織內并未發現YAP蛋白的高表達和入核現象[42-43]。

3 在腸道新生物生成中YAP蛋白與β聯蛋白的交叉協同作用

大腸癌多由結直腸黏膜上皮的良性瘤樣新生物發展而來，大多數大腸癌都存在能引起Wnt信號通路過度活化的突變，其中以引起腫瘤抑制因子APC失活的突變最常見。可見，Wnt通路和APC蛋白在大腸新生物發生、發展過程中起重要作用。

β聯蛋白是Wnt/β聯蛋白信號通路中最重要的轉錄共激活因子。Wnt/β聯蛋白信號通路激活時，β聯蛋白的磷酸化和降解均被抑制，并在胞質不斷積累，后轉位入核與T細胞因子/淋巴增強結合因子特異性轉錄因子結合，激活與細胞增殖、凋亡及分化有關的靶基因表達survivin、C-myc、細胞周期蛋白D1等蛋白，導致細胞異常增殖，從而促進腫瘤的發生[44-45]。Wnt/β聯蛋白信號通路受APC蛋白的負性調節，其失活可引發大腸癌。研究發現，YAP蛋白可與APC和β聯蛋白相互影響，從而介導Hippo信號通路與Wnt/β聯蛋白通路間的相互作用[46-47]。

β聯蛋白可與YAP蛋白在抗凋亡基因B細胞淋巴瘤/白血病2相關蛋白1及survivin的啟動子形成β聯蛋白-YAP-Tbx5復合物，共同調節細胞增殖、凋亡及分化[48]。隨后研究發現，YAP基因也是Wnt/β聯蛋白通路的直接靶基因，β聯蛋白與YAP基因的啟動子結合調節YAP蛋白表達，抑制β聯蛋白表達可導致YAP蛋白信使RNA水平減少。研究表明，過表達的YAP蛋白和β聯蛋白可共同驅動大腸癌細胞的增殖[49-50]。

研究發現胞質中被Hippo通路磷酸化抑制的YAP蛋白可通過其TEAD結合區與β聯蛋白的N端結合，使β聯蛋白滯留在胞質，并抑制其活性和入核激活靶基因功能。上游使YAP蛋白磷酸化的哺乳動物不育系20樣激酶1/2的失活可導致Wnt/β聯蛋白活性增強，進一步說明YAP蛋白與β聯蛋白具有交叉協同作用[51-52]。

APC作為β聯蛋白的負性調節因子，亦是人大腸癌中突變率較高的腫瘤抑制因子[53]。在Wnt通路中，APC可抑制YAP基因轉錄，APC缺失可致YAP蛋白入核激活YAP-TEAD依賴的轉錄，并促進腫瘤的發展[46]。在APC突變小鼠結腸癌細胞中YAP蛋白被激活，敲除YAP基因后可抑制小腸和結腸中因APC突變引起的腺癌形成[41]。現已知APC對YAP蛋白的抑制調節有通過β聯蛋白形成蛋白復合體下調YAP基因表達和通過聯合Hippo通路級聯磷酸化YAP蛋白兩種機制[36,54]。

4 YAP蛋白在大腸癌“炎癥-異型增生-腫瘤路徑”的發生過程中的作用

“炎癥-異型增生-腫瘤路徑”是與經典“腺瘤性息肉-癌路徑”不同的大腸癌發生機制。有研究表明，腸道干細胞可在葡聚糖硫酸鈉和博來霉素誘導的損傷中上調Yki基因的表達，隨后活化Yki蛋白激活Janus激酶，并協同細胞因子Upd產生促細胞增殖作用，從而闡述Yki基因介導細胞損傷時增殖修復發生的部分機制[55-56]。對小鼠的實驗發現，正常狀態下的YAP蛋白缺陷不會導致明顯的腸上皮缺損，可見YAP蛋白并不是腸道生長發育過程的必需蛋白；但若對YAP蛋白缺陷小鼠使用葡聚糖硫酸鈉，則會造成比YAP蛋白正常表達小鼠更嚴重的腸上皮損傷，可見YAP蛋白在腸道黏膜損傷后修復中起重要作用[43]。在腸道炎癥反應(如潰瘍性結腸炎)中，YAP蛋白作為原癌蛋白在胞質內濃度上升，并與β聯蛋白進入細胞核內結合形成轉錄起始復合物，參與損傷上皮修復，但過度表達的YAP蛋白也誘導了息肉結構的形成，經免疫組織化學檢查提示，其結構不同于APC缺陷所形成的息肉，隨著上皮更新修復的持續進行仍可引起炎癥相關性腸癌[57]。

5 YAP蛋白在大腸新生物診療中的研究進展

5.1YAP蛋白的表達對癌組織惡性程度及患者預后的預測作用 YAP蛋白可作為生物標志物運用于臨床。有研究表明，YAP蛋白的表達量在大腸癌病灶周圍正常組織、大腸腺瘤組織和大腸癌組織中依次遞增，各組間差異有統計學意義[58]。手術切除大腸癌病灶并做淋巴組織清掃后發現，YAP蛋白表達量與附屬淋巴結侵犯情況相關[59]。由此可見，YAP蛋白的表達可能提示大腸病變組織的惡性程度及大腸癌患者的預后。

5.2以YAP蛋白為靶點的癌癥治療進展 YAP蛋白有促進腫瘤發生發展的作用，在很多類型的癌癥組織中高表達，可將YAP蛋白作為藥物靶點應用于具有YAP蛋白高表達的癌癥類型的治療研究。YAP-TEAD復合物可激活大多數與YAP蛋白高表達相關腫瘤的原癌基因，故可對兩者的結合進行干擾[60-61]。研究發現氟芬那酸作為常見的非甾體抗炎藥，可與TEADs的疏水區結合，干擾YAP蛋白與TEADs的相互作用，從而抑制與YAP蛋白相關的轉錄和細胞增殖等[62]。轉錄輔助因子退變樣蛋白4的Tondu結構域可與YAP蛋白競爭結合TEADs，從而抑制YAP蛋白相關腫瘤的生長，并基于轉錄輔助因子退變樣蛋白4與TEADs相互作用原理，設計出了一種肽段用于干擾YAP-TEADs復合物的形成，抑制原發性胃癌細胞的生長，從而為YAP蛋白高表達的腫瘤治療提供新的可能性[63]。經高通量篩選發現，維替泊芬能有效干擾YAP蛋白與TEADs的結合，并具有抑制YAP蛋白過表達引起的肝臟生長的作用[60]。

血管生成抑制素結合蛋白可促進YAP蛋白磷酸化，并可通過相互結合的方式阻止其入核，故可通過加強血管生成抑制素結合蛋白的作用來抑制YAP蛋白入核。研究顯示，端錨聚合酶類可通過作用E3泛素連接酶RNF146促進血管生成抑制素結合蛋白的降解，故作為端錨聚合酶類抑制因子的XAV939，Wnt反應抑制劑1，G007-LK、G244-LM可發揮抑制血管生成抑制素結合蛋白降解的作用，從而間接拮抗YAP蛋白活性[64-66]。端錨聚合酶類抑制因子對YAP蛋白高表達腫瘤的治療有一定潛力，但具體效果仍需進一步研究。

YAP蛋白可通過WW結構域與含有PPXY基序的蛋白結合，并發生相互作用[67-68]。研究顯示，WW結構域與WW結構域結合蛋白2 結合可增強YAP蛋白的促轉錄作用，反之WW結構域的突變可抑制YAP蛋白促進原癌基因轉錄的作用[69-72]。故可使用能與YAP蛋白WW結構域結合的物質來抑制其致癌作用。有研究發現洋地黃可通過結合于WW結構域的疏水區來抑制腫瘤細胞中YAP蛋白的活性[73-75]。但有研究指出，大腫瘤抑制基因1和類血管生成抑制素結合蛋白1可與YAP蛋白的WW結構域結合，對YAP蛋白進行負性調節，如乳腺上皮細胞中WW結構域缺陷導致YAP蛋白激活，從而導致細胞遷移和轉化，故以WW結構域為靶點治療腫瘤增生，應考慮細胞組織環境的差異，否則可能激活YAP蛋白[29-30,32]。

6 小 結

隨著對Hippo通路組成成分和YAP蛋白在腸上皮炎癥反應和異常增生中表達的不斷研究，YAP蛋白在結腸新生物生成以及向惡性腫瘤發展過程中的作用正逐漸被揭示。YAP蛋白作為原癌蛋白可直接上調增生相關基因的表達，亦可與其他涉及細胞增殖的信號通路相互作用，發揮促進細胞增殖的作用。近年來，通過作用YAP蛋白及其上下游分子抑制YAP蛋白活性，不斷推進腫瘤生長變化的研究發現，抑制大腸癌細胞內過表達的YAP蛋白，腫瘤生長可出現不同程度減弱[60-66]。研究發現隨著大腸新生物惡性程度的升高，細胞內YAP蛋白的表達量和核定植情況也在上升[58-59]。上述研究在分子層面進一步闡釋了大腸癌的發生發展機制，同時提出了可用于研究大腸癌治療的多個潛在靶點和預測腫瘤惡性程度標志物。因此，YAP蛋白和大腸腫瘤的關聯性研究將為大腸癌的診治提供新的視野。