NLRP3炎癥小體與腹膜透析患者腹膜纖維化的研究進展

胡清華，羅綺媚，鐘少鑫，竇獻蕊

(南方醫科大學順德醫院腎內科，廣東 佛山 528300)

腹膜透析是以自身腹膜作為半透膜進行溶質和水跨膜轉運的一種透析方式，具有可居家治療、更好保護殘余腎功能、對血流動力學影響小等優點，已逐漸成為終末期腎衰竭患者的首選治療方法之一。腹膜結構和功能變化是影響腹膜透析治療的關鍵因素，長期行腹膜透析治療患者的腹膜普遍存在纖維化，腹膜纖維化引起的超濾衰竭是影響腹膜透析患者技術生存的重要因素[1]。目前，腹膜纖維化的發病機制尚未完全闡明。研究表明，腹膜炎與腹膜纖維化密切相關，腹膜透析相關性腹膜炎癥包括微炎癥狀態和由感染引起的急性和慢性腹膜炎，兩者結合是腹膜纖維化的主要原因，最終導致超濾衰竭[2]。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是近年來研究最多的復合體，可引起強效促炎因子白細胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的成熟和釋放。現對NLRP3炎癥小體參與腹膜透析相關性腹膜炎癥和腹膜纖維化的機制予以綜述。

1 NLRP3炎癥小體及其激活模式

1.1NLRP3炎癥小體的結構和功能 固有免疫系統可通過特定的模式識別受體識別入侵的微生物以及體內的危險信號，最終排除異己成分、保護宿主，炎癥小體是固有免疫的重要效應因子。模式識別受體包括膜結合的Toll樣受體和胞質內的Nod樣受體。NLRP3是Nod樣受體家族中研究最多的一種，可被多種刺激信號激活，并募集凋亡相關斑點樣蛋白及胱天蛋白酶1組成多蛋白復合體——NLRP3炎癥小體[3-4]。NLRP3蛋白由位于染色體1q44上NLRP3基因編碼，包含1 016個氨基酸，分子結構包括C端、中央和N端3部分，C端是識別配體的亮氨酸富集結構域；中央為實現NLRP3寡聚化和活化的NOD結構域；N端為介導下游信號轉導的熱結構域[3]。凋亡相關斑點樣蛋白作為一種銜接蛋白，其C端為結合NLRP3的下游信號轉導的熱結構域，N端為結合胱天蛋白酶1的CARD結構域。胱天蛋白酶1是前胱天蛋白酶1的活化形式，通過激活蛋白裂解使IL-1β、IL-18等細胞因子前體成熟，并發揮生物學效應。當內源危險信號刺激或外源病原毒素侵襲激活NLRP3時，與凋亡相關斑點樣蛋白結合，并進一步募集前胱天蛋白酶1，誘導前胱天蛋白酶1進行自我剪切生成活化的胱天蛋白酶1，通過對相應炎性因子的剪切激活，最終引發炎癥反應[5]。

1.2NLRP3炎癥小體的活化過程 目前對NLRP3炎癥小體激活的具體機制尚不清楚，但已知的激活模式主要有：①半通道模式，胞外的腺苷三磷酸能夠與細胞膜上P2X7嘌呤受體結合開通離子通道，大量K+外流，同時促進半通道蛋白Pannexin-1通道形成，使細胞外NLRP3配體進入細胞內，直接促進NLRP3炎癥小體的聚集和活化。②溶酶體破壞模式，一些晶體物質(如石英、二氧化硅、單鈉尿酸鹽等)被吞噬細胞吞噬后，將溶酶體破壞，使溶酶體中一系列蛋白酶釋放到胞質中，直接激活NLRP3炎癥小體。③活性氧類(reactive oxygen species，ROS)模式，細胞接受刺激時，氧化酶組裝活化，線粒體合成ROS，產生的ROS可以作為信號激活NLRP3炎癥小體。④其他模式，細胞外葡萄糖、細菌RNA、線粒體DNA等均可激活NLRP3炎癥小體[6-7]。

2 NLRP3炎癥小體與腹膜透析相關腹膜纖維化

2.1NLRP3炎癥小體與細菌感染所致腹膜炎 細菌感染所致腹膜炎是腹膜透析的常見并發癥，其反復發生會嚴重影響腹膜超濾功能和透析效能，最終使患者退出腹膜透析。腹膜透析患者發生急性細菌性腹膜炎可激活NLRP3炎癥小體，促進其下游多種促炎介質(如IL-1β、IL-18等)的合成和分泌，與腹膜結構和功能密切相關。Hautem等[8]在發生急性細菌性腹膜炎的腹膜透析患者和用脂多糖誘導的腹膜炎大鼠模型腹膜組織研究中發現，NLRP3和IL-1β的信使RNA表達均明顯增加，同時腹水中IL-1β表達亦明顯升高，且NLRP3和IL-1β激活程度與透析液中中性粒細胞增加的比例呈正相關。若敲除NLRP3基因，IL-β表達受到抑制，同時，在急性腹膜炎時發生的溶質轉運障礙又得到恢復，可見，腹膜透析患者發生急性細菌性腹膜炎時可激活NLRP3炎癥小體，并促進下游多種促炎介質(如IL-1β、IL-18 等)的合成和分泌。一項納入210例感染性腹膜炎腹膜透析患者的研究顯示，腹水中炎性因子IL-1β、IL-6和轉化生長因子β均明顯升高[9]。IL-1β是NLRP3炎癥小體下游重要的促炎因子，過度和(或)持續激活可造成廣泛組織損傷。將腺病毒轉載IL-1β至尿毒癥大鼠腹膜組織可引起炎性細胞浸潤，隨即發生嚴重的急性腹膜炎，即使腹膜炎癥狀緩解，促炎因子仍釋放達數周，并可潛在影響腹膜形態和功能[10]。有研究發現，腹膜透析患者中IL-1β的基因多態性與腹膜炎相關，C等位基因攜帶者與腹膜炎的風險增加有關[11]。同時，IL-1β有望作為鑒別各種類型腹膜炎的生物標志物，有助于選擇適當的抗生素治療[12]。

2.2NLRP3炎癥小體與慢性非細菌性腹膜炎 殘余腎功能下降、尿毒癥毒素、透析所致暴露增加、高糖和低pH溶液反復刺激等原因可引起腹膜透析患者腹膜慢性非細菌性炎癥反應，促使腹膜間皮細胞轉分化亦是腹膜纖維化的重要環節之一[13]。長期行腹膜透析患者非細菌性炎癥發生率高，且與腹膜纖維化的發展速度呈正相關[14-15]。有研究發現，NLRP3炎癥小體可介導高濃度葡萄糖透析液誘導的腹膜慢性非細菌炎癥反應，高糖刺激腹膜間皮細胞后，IL-1β和IL-18表達明顯升高，且呈時間和劑量依賴性，用干擾小RNA下調腹膜間皮細胞NLRP3的表達時，由高糖刺激產生的IL-1β明顯減少。IL-1β和IL-18是重要的促炎因子，可導致下游IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α等炎性因子的表達增加，這些炎性因子相互作用形成復雜的網絡結構共同參與炎癥反應，最終導致腹膜結構和功能變化[16-17]。Chin等[18]發現，慢性腎臟病狀態下機體代謝廢物(如尿毒癥毒素)可活化NLRP3炎癥小體。晚期腎衰竭患者和透析患者(包括血液透析和腹膜透析)血清中促炎細胞因子IL-1β、腫瘤壞死因子α和IL-6表達均明顯升高，且與腎小球濾過率呈負相關[19]。由此推測，當腹膜長期直接暴露于異常代謝環境，細胞內穩態發生改變，繼而可產生多種危險信號分子(如ROS、腺苷三磷酸等)。危險信號分子被細胞內模式識別受體識別后可激活NLRP3炎癥小體，通過效應分子胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18等作用于腹膜間皮細胞，使其發生細胞凋亡或上皮-間質轉化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，從而導致腹膜纖維化。

2.3NLRP3炎癥小體與腹膜纖維化 腹膜結構和功能的改變是影響腹膜透析治療的關鍵因素，長期腹膜透析患者的腹膜組織中可觀察到間皮下層的厚度逐漸增加，并伴隨腹膜纖維化形成，這些慢性改變在患者發生嚴重或反復發生腹膜炎時更加明顯[20]。一項對212例腹膜透析患者進行的腹膜組織檢查發現，正常人不存在腹膜纖維化，腹膜透析患者活檢組織中腹膜纖維化的發生率高達56%[21]。反復發生的急慢性腹膜炎是導致腹膜間皮細胞發生EMT的主要原因，而EMT是腹膜透析相關腹膜纖維化的重要機制，最終導致超濾衰竭使患者透析終止[22]。

體外研究發現，IL-1β可呈劑量依賴性地誘導腎小管及腫瘤細胞等發生EMT，并參與腫瘤細胞的遠處轉移[23-24]。高糖腹膜透析液可活化腹膜間皮細胞的NLRP3，呈時間和劑量依賴性，并誘導腹膜間皮細胞發生EMT，將NLRP3干擾小RNA轉染至間皮細胞，沉默NLRP3的表達，結果發現，可部分抑制含糖腹膜透析液誘導的腹膜EMT[25]。IL-1β刺激間皮細胞時，纖維化指標纖維連接蛋白表達增加，并發生可逆性的EMT，轉分化的間皮細胞中上皮鈣黏素的分泌減少，伴細胞外基質、波形蛋白和平滑肌肌動蛋白成分等增加[26]。綜上所述，NLRP3炎癥小體活化可介導高糖腹膜透析液誘導的腹膜間皮細胞轉分化。

用腺病毒轉載IL-1β至尿毒癥大鼠腹膜組織后可引起急性腹膜炎癥，腹膜組織中轉化生長因子β和纖維連接蛋白的信使RNA表達明顯增加，膠原沉積，并出現間皮下纖維組織變厚、腹膜纖維化，進而導致腹膜超濾功能下降，但腹膜炎癥狀在1周左右可緩解，由于纖維連接蛋白信使RNA的表達在21 d后仍有持續升高趨勢，故腹膜纖維化可持續至21 d甚至更長時間[10]。大鼠實驗中用丙戊酸作用轉化生長因子β/Smad通路抑制腹膜纖維的同時，炎性因子IL-1β的表達明顯降低[27]。綜上所述，NLRP3/IL-1β參與并調控腹膜透析相關腹膜炎以及腹膜纖維化的發生、發展過程，具體作用機制尚不明確，但臨床上當患者經歷一次或數次腹膜炎后，腹膜纖維化的程度會明顯增加，而IL-1β可能起重要作用。干預NLRP3炎癥小體的活化可能對延緩腹膜纖維化有重要意義。

3 NLRP3炎癥小體與線粒體損傷

NLRP3炎癥小體是溝通腹膜透析相關腹膜炎癥和腹膜纖維化的橋梁，但其具體調節機制尚不明確。研究發現，NLRP3炎癥小體活化與線粒體的損傷、代謝和自噬密切相關[28-29]。線粒體是真核細胞內的能量轉換細胞器，除提供細胞生命活動所需能量外，還參與調控細胞內環境鈣離子濃度的穩定、凋亡、細胞信號轉導和衰老等功能[30]。目前，越來越多的研究證明，NLRP3炎癥小體參與腹膜透析相關腹膜纖維化的過程可能受到線粒體的調控[31-33]。闡明NLRP3炎癥小體和線粒體的關系可為延緩腹膜纖維化提供新思路。

3.1NLRP3炎癥小體和ROS 線粒體發生功能障礙時，ROS的產生超過機體清除能力，過量ROS激活相關信號通路引起細胞損傷。近年來，線粒體來源的ROS被認為是NLRP3炎癥小體的調控中心[34]。研究表明，線粒體靶向抗氧化劑阻斷ROS的產生可抑制腎小管上皮細胞NLRP3炎癥小體的激活以及細胞損傷[35]。高糖培養腹膜間皮細胞時，ROS產生增加，與時間和劑量呈正相關，而過量的ROS使NLRP3炎癥小體激活，導致IL-1β的分泌[36]。ROS是瞬態分子，只在短距離內充當信號信使，因此被定位在靠近線粒體的有效NLRP3才能對該細胞器產生的ROS進行有效的信號轉導。在慢性腎臟病血液透析患者外周血單個核細胞的線粒體中發現，NLRP3與凋亡相關斑點樣蛋白、線粒體共區域化，而正常人群外周血單核細胞中，NLRP3殘留在細胞質顆粒結構中[37]。進一步證實了線粒體來源的ROS可激活NLRP3炎癥小體。有研究用高糖以及線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ抑制劑魚藤酮、線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅱ抑制劑TTFA、線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ抑制劑抗霉素A分別處理人腹膜間皮細胞誘導線粒體功能障礙發現，高糖、魚藤酮和劑抗霉素A可使線粒體ROS產生增加，IL-1β表達上調，而TTFA對ROS和IL-1β表達無明顯影響，表明應用高糖腹膜透析液或線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ和線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ抑制劑會導致ROS升高和IL-1β高表達[37]。NLRP3炎癥小體是調控IL-1β表達的關鍵分子，應用微RNA技術下調NLRP3的表達后，由高糖透析液和線粒體呼吸鏈抑制劑作用于腹膜間皮細胞產生的IL-1β表達均明顯減弱，表明高糖腹膜透液可損傷腹膜間皮細胞線粒體功能，產生更多的ROS并激活NLRP3炎癥小體，其機制可能與線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ和線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ活性增強有關，并在腎小球系膜細胞中也得到了類似的結果[37-38]。

3.2NLRP3炎癥小體活化與線粒體DNA 線粒體DNA是線粒體內的遺傳物質，線粒體功能障礙時，從線粒體釋放至胞質，成為損傷相關分子模式[38]。有研究發現，巨噬細胞線粒體功能障礙時釋放至胞質的線粒體DNA可直接結合并活化NLRP3炎癥小體，介導下游炎性因子IL-1β等的合成和分泌，參與炎癥反應和組織損傷[29,39]。將腹膜間皮細胞暴露在高糖透析液中，可觀察到線粒體膜電位的消散，并伴隨細胞色素C、ROS和線粒體DNA的產生以及釋放的明顯增加[40]。有研究表明，循環線粒體DNA水平與慢性腎臟病患者全身炎癥狀態顯著相關，并發現慢性腎臟病患者尿液中線粒體DNA濃度明顯升高，與腎小球濾過率呈負相關，有可能作為半段是否需要透析治療的指標之一[41]。一項納入197例腹透患者的研究發現，循環線粒體DNA水平明顯升高，與血清C反應蛋白水平呈正相關[42]。綜上所述，線粒體DNA可能參與腹膜透析患者的炎癥反應，但是否通過調控NLRP3炎癥小體仍不明確，需要體內外實驗的進一步探究。

3.3NLRP3炎癥小體活化與自噬 線粒體是一種易損傷的細胞器，及時清除細胞內受損線粒體對維持細胞正常生理狀態具有重要作用。細胞內功能受損的線粒體主要通過自噬進行清除[43]。有研究報道，敲除自噬基因ATG16L1或ATG7的巨噬細胞中，IL-1β表達量增多，而IL-1β的成熟與釋放依賴于NLRP3炎癥小體活化，表明自噬可能調節NLRP3炎癥小體的活性[44]。在體外培養的腹膜間皮細胞中加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干擾自噬形成的關鍵蛋白(Beclin1干擾小RNA、ATG5干擾小RNA)作為自噬阻斷劑后發現，受損線粒體增多，線粒體釋放的ROS增多，IL-1β表達量亦明顯增強，而用白藜蘆醇誘導細胞自噬后，NLRP3炎癥小體激活上調IL-1β表達的效應卻明顯減弱[34]。可見，抑制自噬過程可使功能障礙的線粒體在胞內堆積并產生大量ROS激活NLRP3炎癥小體，而適度自噬可維持線粒體功能，并可抑制NLRP3炎癥小體的激活。此外，NLRP3炎癥小體激活后亦可抑制自噬，影響線粒體的自我清除，對動脈粥樣硬化等疾病的發展起促進作用[45]。由此推測，行腹膜透析時，腹膜間皮細胞受到炎癥、高糖、低pH腹膜透析液刺激，細胞線粒體損傷，ROS和線粒體DNA等產生明顯增加，激活NLRP3炎癥小體及其下游炎性因子參與腹膜透析相關腹膜炎癥及腹膜纖維化，而線粒體自噬又可抑制以上過程的持續激活。

4 小 結

腹膜透析受到各種感染及非生物相容性腹膜透析液等的反復刺激，可導致NLRP3炎癥小體的激活，并通過活化的半胱氨酸蛋白酶1持續地將前IL-1β和前IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18，進而激活其下游信號轉導通路產生大量炎性介質，引起機體炎癥反應和腹膜纖維化。NLRP3炎癥小體在腹膜透析相關腹膜炎癥和腹膜纖維化的重要性受到越來越多的關注。目前，以NLRP3炎癥小體為靶點的藥物也正在做有益的嘗試，但具體調控機制仍不明確。腹膜透析時，線粒體損傷在NLRP3炎癥小體的激活過程中起重要作用，線粒體損傷有關的ROS、線粒體DNA以及自噬均與各組織器官的纖維化密切相關，其在腹膜纖維化的重要性也日益受到關注。可見，用保護線粒體功能的方法抑制NLRP3炎癥小體激活可能為探索延緩腹膜纖維化提供新思路。