金屬β內酰胺酶及其抑制劑的研究進展

鞠林成，史亞興，苗東旭，殷 波,宋永勝

(中國醫科大學附屬盛京醫院泌尿外科，沈陽 110004)

細菌感染是臨床中十分常見的感染性疾病。患者一旦發生細菌感染，往往使其住院時間延長、醫療支出增加，尤其是醫院獲得性感染可以增加患者病死率[1]。臨床中針對細菌感染最重要的策略是給予患者抗生素治療，青霉素(一種β內酰胺類抗生素)是最早在臨床中大規模使用的抗菌藥物，目前臨床中的β內酰胺類包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和單環β內酰胺類。隨著制藥工業的不斷改進，β內酰胺類具有血藥濃度高、抗菌譜廣和毒性低的抗菌特點，是目前全球范圍內應用最廣、使用率最高的一類抗生素[2]。文獻報道，在所有種類的抗菌藥物中，β內酰胺類在美國的使用率已經超過65%[3]。β內酰胺類可以靶向作用于一種位于細菌細胞壁上的關鍵酶——轉肽酶，并通過共價結合的形式與轉肽酶的活性位點結合，降低細菌細胞壁的機械強度，限制細菌細胞壁合成[4]，而且該類抗生素還可以通過共價修飾的方式抑制細菌細胞壁聚肽糖層合成的關鍵酶——青霉素結合蛋白，使得細菌細胞壁完整性缺失，最終導致細菌細胞溶解[5]。但與臨床中應用的其他種類抗菌藥物所面臨的情況相同，隨著β內酰胺類的過度使用，臨床中的主要致病菌(如革蘭陰性菌中的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，以及革蘭陽性菌中的肺炎鏈球菌和金黃色葡萄球菌)不斷出現耐藥菌株并在全球范圍內迅速播散，使β內酰胺類這一有效的抗菌武器正在失去效力，細菌耐藥已成為臨床中不容忽視的嚴重問題。細菌對β內酰胺類的耐藥機制可以分為4種：細菌以主動泵出的形式將進入細胞內的藥物泵出細胞外；降低外膜滲透性減少抗生素進入細胞內；細菌通過自身突變或產生某種酶修飾抗生素的作用靶點導致靶點的結構發生變化進而使藥物作用降低或無法發揮作用；表達β內酰胺酶使抗生素失去活性[6]。而且細菌還會同時具有一種以上的耐藥機制，且彼此之間產生協同作用，最終也可導致對抗生素的耐藥[7]。臨床中主要致病菌最重要的耐藥機制是表達β內酰胺酶。β內酰胺酶是一種水解酶，可以催化水解β內酰胺類抗生素的特征性四元環，進而使β內酰胺類結構發生改變產生無效產物，最終導致該類抗生素失去抗菌活性。現就金屬β內酰胺酶(metallo-β-lactamases，MBLs)及其抑制劑的研究進展進行綜述。

1 β內酰胺酶的分類

目前文獻報道的β內酰胺酶有2 000多種[8]，依據氨基酸序列的不同可將β內酰胺酶分為A、B、C和D四類[9]。其中A、C和D類依靠酶活性位點的絲氨酸表達催化活性，因此被稱為絲氨酸β內酰胺酶(serine-β-lactamases，SBLs)。1940年，Abraham和Chain報道了第1例SBLs[10]，至今SBLs的數量已經超過了1 000種。在臨床上，克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿維巴坦這4類抑制劑可以抑制SBLs的催化活性，恢復β內酰胺類抗生素對細菌的抗菌活性[11]。因此,這些抑制劑與β內酰胺類抗生素構成的復合物可用來治療表達SBLs細菌引起的感染性疾病。與A、C和D三類β內酰胺酶不同，B類β內酰胺酶依靠活性位點的1～2個Zn2+表達催化活性，因此被稱為MBLs[9]。

2 MBLs的結構

MBLs之間的氨基酸序列同源性低，文獻報道小于25%[12]。所有的MBLs都含有αβ/βα的特征性結構，即β折疊在內側，α螺旋位于外側。兩個α螺旋與β折疊構成的結構域之間是酶的活性位點，活性位點有Zn2+結合。根據活性位點金屬離子的個數以及活性位點金屬離子結合氨基酸的不同，MBLs又可分為3個亞群：B1、B2和B3亞群[13]。B1和B3亞群MBLs活性位點有2個Zn2+，可以水解青霉素類、頭孢菌素類及碳青霉烯類抗生素。B2亞群MBLs活性位點有1個Zn2+，專一水解碳青霉烯類抗生素。B1亞群MBLs的第1個Zn2+結合3個組氨酸并通過1個氫氧化物與第2個Zn2+連接，形成四面體配位結構；第2個Zn2+結合1個組氨酸、1個半胱氨酸、1個天冬氨酸和1個水分子，并由1個氫氧化物與第1個Zn2+連接，形成三角雙錐體配位結構；B2亞群MBLs活性位點的Zn2+結合1個組氨酸、1個半胱氨酸和1個天冬氨酸；B3亞群與B1亞群結構類似，不同之處在于第2個Zn2+結合2個組氨酸和1個天冬氨酸。

3 MBLs與臨床感染的相關性

B1亞群MBLs數量最多且大部分與臨床有相關性，如在多種革蘭陰性致病菌中發現的亞胺培南酶(imipenemases，IMPs)、維羅那亞胺培南酶(Verona imipenemases，VIMs)和新德里金屬β內酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamases，NDMs)，以及在銅綠假單胞菌中發現的巴圣保羅金屬β內酰胺酶1(S?o Paulo metallo-β-lactamases 1,SPM-1)、蠟樣芽孢桿菌中發現的β內酰胺酶Ⅱ、脆弱擬桿菌中發現的耐碳青霉烯和頭孢菌素酶以及腦膜炎膿毒菌中發現的β內酰胺酶B。B2亞群MBLs數量最少，包括嗜水氣單胞菌中發現可以水解碳青霉烯類的MBLs、維氏氣單胞菌中發現的亞胺培南酶和居泉沙雷菌中發現對碳青霉烯類耐藥的MBLs。B3亞群MBLs多存在于機會致病菌中，主要包括嗜麥芽窄食單胞菌中發現的L1型MBLs和戈爾曼軍團菌中發現的MBLs[12,14]。

1966年(大約在SBLs發現的25年后)，Sabath和Abraham[15]首次在一種名為蠟樣芽孢桿菌的非致病菌中發現了一種含有金屬鋅并且可以被乙二胺四乙酸(一種金屬離子的螯合劑)抑制的β內酰胺酶。在此之后的20年中，由于發現的MBLs主要存在于非致病菌中，沒有造成嚴重的臨床問題，因此MBLs并沒有引起足夠的關注。隨著時間的推移，研究發現MBLs可以由染色體編碼在多種細菌中傳播，如脆弱擬桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、產氣單胞菌以及金黃桿菌屬，而且在腸桿菌屬、銅綠假單胞菌、黏質沙雷菌及不動桿菌屬致病菌中還發現了質粒介導的MBLs耐藥基因[14]。重要的是，除單環β內酰胺類抗生素外，MBLs可以水解包括碳青霉烯類在內的其他所有的β內酰胺類抗生素[16]。與SBLs不同，目前臨床上還沒有任何一種針對MBLs的抑制劑可以抑制MBLs的活性。MBLs耐藥基因在細菌中傳播使其成為“超級細菌”，導致臨床上的抗生素失去效力，使越來越多的細菌感染性疾病無藥可用。其中播散程度最為廣泛、與臨床關系最為密切的是IMPs、VIMs和NDMs[12]。

1991年，日本學者在銅綠假單胞菌中發現了一種可以水解亞胺培南的β內酰胺酶，即IMP-1[17]。目前美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)有73個IMPs的變異型，IMPs主要在日本流行。VIM-1是在意大利維羅那發現并于1999年被報道的[18]，NCBI可查到56個VIMs的變異型，VIMs主要在歐洲流行。

NDM-1最早報道于2009年，1例由印度新德里返回瑞典的患者患有泌尿系感染，其尿液中發現了耐碳青霉烯的肺炎克雷伯菌菌株，該菌株攜帶NDM-1基因[19]，目前NCBI上報道了21個NDMs變異型。雖然NDM-1比IMP-1和VIM-1出現的較晚，但是其播散呈全球趨勢且不受地域限制，而且在假單胞菌屬、腸桿菌屬和不動桿菌屬等多種革蘭陰性菌中均發現了NDM-1[20]。新近研究顯示，NDM的臨床變異型在Zn2+濃度較低的情況下仍然具有生物活性[21-22]。

4 MBLs抑制劑

美國疾病控制與預防中心于2017年1月報道了1例感染了耐碳青霉烯腸桿菌的患者，該患者感染了產NDM-1的肺炎克雷伯菌。藥敏試驗顯示該細菌對26抗生素耐藥，包括氨基糖苷類抗生素及多黏菌素，而且對替加環素亦不敏感，最終該患者死于細菌感染[23]。

在所有引起院內感染的致病菌中，對人類健康威脅最大的是被稱為ESKAPE的這一類病原體，即E(Enterococcusfaecium，屎腸球菌)、S(Staphylococcusaureus，金黃色葡萄球菌)、K(Klebsiellapneumoniae，肺炎克雷伯菌)、A(Acinetobacterbaumanii，鮑曼不動桿菌)、P(Pseudomonasaeruginosa，銅綠假單胞菌)及E(Enterobacter，腸桿菌)[24]。表達NDM-1的ESKAPE病原體可以抵抗具有“終極手段”之稱的碳青霉烯類藥物，消除此類素抗生素的抗菌活性[25]。表達MBLs的細菌感染已成為臨床中越來越突出的問題[26]，而且針對SBLs的抑制劑對MBLs無效[27]，目前臨床上沒有藥物可以治療表達MBLs的細菌引起的感染性疾病。因此，臨床上急需有效的抑制劑來解決MBLs介導的細菌耐藥問題。目前抑制劑研究的普遍策略是通過與MBLs活性位點的Zn2+發生作用，從而抑制MBLs的催化活性，進而恢復β內酰胺類抗生素的抗菌活性。鑒于B1亞群與臨床關系最為密切且尤以其中的IMPs、VIMs與NDMs突出，在此列舉一些與該類MBLs相關的抑制劑。

4.1金屬螯合劑 移除MBLs中的Zn2+可以抑制MBLs活性。乙二胺四乙酸及吡啶二羧酸即屬于該類抑制劑[16]。King等[28]報道了一種名為曲霉明A(aspergillomarasmine A，AMA)的抑制劑，該抑制劑來源于真菌的天然產物。體外實驗中，AMA可以有效抑制NDM-1及VIM-2的活性，與美羅培南聯合可以起到協同作用，提高美羅培南抗腸桿菌屬、假單胞菌屬和不動桿菌屬的抗菌活性。在產NDM-1的肺炎克雷伯菌感染的小鼠動物模型中，AMA也可以提高美羅培南的抗菌活性。后續的研究也證實了AMA通過移除NDM-1及VIM-2活性位點的金屬離子對其產生抑制作用[29]。由于人體內有多種蛋白質需要相應的金屬離子來維持生物活性，應用該類抑制劑的同時會不可避免地影響這些含有金屬離子的蛋白質活性，進而對人體造成損害，限制該類抑制劑的使用。

4.2含巰基抑制劑 在所有報道的MBLs抑制劑中，含有巰基的化合物數量最多，其中L-或D-卡托普利是最經典的含巰基抑制劑。臨床中L-卡托普利是血管緊張素轉換酶的抑制劑，其通過結合血管緊張素轉換酶中的Zn2+起到緩解高血壓的作用[30]。Brem等[31]報道了卡托普利在體外實驗中可以抑制B1亞群的多種MBLs的活性。其中D-卡托普利對IMP-1、VIM-2、SPM-1及NDM-1的半數抑制濃度(inhibitory concentration at half-maximum，IC50)分別為7.2、0.072、261.8及20.1 μmol/L，D-卡托普利還可增強美羅培南對產VIM-2、VIM-4、IMP-4及NDM-1的細菌的抗菌活性。三維結構展示L-卡托普利的巰基取代了NDM-1兩個Zn2+中間的氫氧化物，抑制了NDM-1活性。

Klingler等[32]報道了一系列巰基化合物，其中塞奧芬、二巰基丙醇、巰基丙酰甘氨酸可抑制NDM-1、VIM-1及IMP-7的活性(均IC50<100 μmol/L)。并且這些化合物與亞胺培南聯合應用可提高后者對產NDM-1、VIM-2、IMP-7的大腸埃希菌實驗分離株及肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌病原分離株的抗菌活性。

Hinchliffe等[33]報道了一系列含羥基的雙環噻唑烷化合物，該類化合物是青霉素的類似物并且含有巰基。研究以亞胺培南作為底物。其中名為L-CS319化合物對NDM-1表現為強競爭性抑制作用，抑制常數(Ki)為7 μmol/L、IC50為23 mmol/L。體外實驗中，L-CS319可以恢復亞胺培南對產NDM-1的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌及雷氏普羅威登斯菌的抗菌活性。

4.3羅丹寧衍生物 羅丹寧是一類對青霉素結合蛋白、SBLs和MBLs均有抑制效果的抑制劑。Brem等[34]報道了羅丹寧與VIM-2形成的三維結構，并發現羅丹寧的一種派生物可以連接VIM-2活性位點的兩個Zn2+。除SPM-1外，該派生物對于一系列B1亞群MBLs具有比羅丹寧更強的抑制能力。其對NDM-1、VIM-2及IMP-1的IC50分別為1.05、0.3和0.002 88 μmol/L。

與美羅培南聯合進行的最小抑菌濃度研究顯示，對于表達IMP-1、IMP-4、VIM-4或NDM-1的肺炎克雷伯菌及大腸埃希菌臨床分離株，羅丹寧表現的抗菌活性更強。這一結果可能是不同細胞對兩種抑制劑的利用不同產生的結果。

4.4二羥酸衍生物 鄰苯二甲酸及順丁烯二酸的衍生物是常見的二羥酸類MBLs抑制劑。Hiraiwa等[35]報道的一系列鄰苯二甲酸衍生物，其中對IMP抑制效果最強的一種抑制劑的IC50為0.27 μmol/L。該種鄰苯二甲酸衍生物抑制劑可提高比阿培南對產IMP銅綠假單胞菌的抗菌活性。

Ishii等[36]報道的一種名為ME1071的順丁烯二酸衍生物可以抑制IMP-1及VIM-2的活性，其Ki值分別為0.4和120 μmol/L。該研究同時報道了ME1071可增強頭孢他啶及碳青霉烯類抗生素對產MBL的銅綠假單胞菌的抗菌活性。在小鼠肺炎模型中，Yamada等[37]發現ME1071可增強比阿培南治療產IMP銅綠假單胞菌的感染。

4.5硼酸鹽類 硼酸化物常作為SBLs的過渡態抑制劑，其通過與SBLs中的絲氨酸發生反應產生仿四面體抑制SBLs活性。Brem等[38]報道的一系列環狀硼酸鹽不僅可以通過上述機制抑制SBLs的活性，還可以通過類似的機制抑制青霉素結合蛋白5及多數B1亞群MBLs的活性。其中一種硼酸鹽類抑制劑對IMP-1、VIM-2及NDM-1的IC50分別為1.44、0.003及0.029 μmol/L。體外實驗中該種抑制劑可提高美羅培南對產NDM-1肺炎克雷伯菌的抗菌活性。

該類抑制劑雖然可以抑制SBLs與B1亞群MBLs的活性，但其對B2亞群MBLs的抑制效果很差。

4.6其他 除上文提到的抑制劑外，MBLs的抑制劑還有聯苯氮雜類[39]、吡咯類衍生物[40]、磺酰類化合物[41]、磺胺衍生物[42]、異羥肟酸衍生物[43]及自然產物[44]等。在體外實驗中，這些有機分子均可以抑制一種或幾種MBLs，而且也可以提高β內酰胺類對產MBLs致病菌的抗菌活性。另外，還有一些MBLs抑制劑通過其他作用機制對MBLs產生抑制作用，如包含精氨酸多肽的大分子抑制劑通過改變蛋白質構象達到對MBLs的抑制作用[45]，以及甲酰色酮通過共價結合方式對MBLs產生抑制作用[46]等。

5 展 望

表達MBL的致病菌引起的感染性疾病不斷增多，是亟待解決的臨床問題。從細菌耐藥的歷史來看，其總是伴隨著基因之間的水平傳遞以及地域性傳播。NDM-1的全球播散也印證了這一特點。這也是抗生素應用所帶來的重大挑戰。在過去20多年中，有許多關于MBLs抑制劑的報道。一些研究報道了抑制劑的IC50和(或)Ki值，一些研究報道了三維結構和(或)毒理研究，一些研究還涉及了動物實驗，但是目前的研究還停留在實驗室階段。MBLs種類眾多，而且大多數抑制劑并不能抑制所有的MBLs，MBLs介導的細菌耐藥使β內酰胺類抗生素這一在臨床中應用最為廣泛的藥物失去抗菌活性。研發可逆的、靶向選擇的、具有構效關系的MBLs抑制劑，使其既可以抑制MBLs又能恢復β內酰胺類抗生素活性，是解決這一挑戰的關鍵。