NLRP6炎癥小體在腸道中的功能

魏 薇，牛冰玉，姚樹坤

(1.中國醫學科學院 北京協和醫學院，北京100032； 2.北京中醫藥大學，北京100029； 3.中日友好醫院消化內科，北京 100029)

人體依靠固有免疫和適應性免疫抵御病原體入侵，炎癥小體的活化及下游炎癥因子的分泌對固有免疫具有重要意義，并可將固有免疫與適應性免疫聯系起來[1]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)6是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族亞類NLRP之一，NLRs是一類模式識別受體。目前，較明確的NLRs功能包括以下3方面：①其中一組NLRs是炎癥小體的重要組成部分，可以調節胱天蛋白酶(caspase)1的活化和促炎細胞因子白細胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的轉錄；②NLRs可參與常見細胞內信號通路的負調控(如核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶通路)，從而影響下游細胞因子和趨化因子的表達；③NLRs還可參與抗病毒免疫的調節[2]。以上3種功能均有NLRP6的參與，NLRP6在腸道黏膜宿主-菌群的相互作用中具有關鍵調節作用。現主要結合近年來NLRP6炎癥小體調控腸道菌群、改善腸屏障功能的相關研究，對腸道中NLRP6炎癥小體的功能予以綜述。

1 NLRP6炎癥小體結構及NLRP6表達部位

NLRP6蛋白編碼基因位于人第11號染色體，N端為熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)，中間為核苷酸偶聯結構域(NACHT/NOD)，C端為富含亮氨酸的重復序列。NLRP6可與caspase-1和含CARD結構域的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)通過PYD-PYD連接作用組成細胞內多聚蛋白復合物，稱為NLRP6炎癥小體，N端的PYD為NLRP6炎癥小體組裝的核心結構，其中的細絲狀結構可募集ASC的PYD[3]。NLRP6可在小鼠各器官表達，如膀胱、腎臟、肝臟、肺、十二指腸、回腸、盲腸和結腸等，其中在結腸肌成纖維細胞表達最高，其次為結腸上皮細胞、肝細胞、CD4+T細胞、樹突狀細胞、CD8+T細胞、肥大細胞，此外，在外周巨噬細胞亦有少量表達[4-5]。而人體NLRP6主要在小腸表達[6]。

2 NLRP6炎癥小體在腸道中的功能

2.1NLPR6炎癥小體與腸道菌群的相互作用

2.1.1腸道菌群對NLRP6炎癥小體的激活作用 NLRP6炎癥小體的活化受腸道菌群調節，腸道菌群提供兩種激活信號：第一種為Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)配體，促進炎癥小體成分和IL-18的轉錄；第二種包括一些微生物代謝物，如膽汁酸、氨基酸、組胺等；共生原生動物也可調節上皮細胞對IL-18的分泌，但目前機制尚不明確[2]。對圍生期大鼠和小鼠的研究顯示，微生物在腸道定植后，NLRP6炎癥小體成分及其下游炎癥因子 IL-18 表達上調，可見微生物可促進NLRP6炎癥小體成分的轉錄及組裝[7-8]。

腸道菌群代謝產物方面，牛磺酸、碳水化合物和長鏈脂肪酸在野生型(wild type，WT)小鼠中較Asc-/-小鼠多，提示牛磺酸、碳水化合物和長鏈脂肪酸可能是NLRP6炎癥小體的激活劑，其中牛磺酸誘導IL-18的作用最強；相反，組胺和精胺在WT小鼠中較Asc-/-小鼠少，并導致腸道IL-18減少，提示組胺和精胺可能對NLRP6炎癥小體有抑制作用[8]。炎癥小體的活化導致caspase-1依賴的促炎細胞因子(IL-18)的分泌，可能以內分泌的方式觸發細胞因子相應受體，并促進抗原提呈、共刺激分子上調及細胞因子釋放，最終刺激抗原特異T細胞和B細胞[9]。除微生物相關機制外，NLRP6炎癥小體成分的負轉錄調節還與促腎上腺皮質激素釋放激素有關。有研究發現，避水應激建立動物模型的血清促腎上腺皮質激素釋放激素升高，小腸和結腸NLRP6表達降低，并出現腸道菌群改變以及腸道屏障功能降低[2,10-11]。

2.1.2NLRP6炎癥小體對腸道菌群的調節作用 目前，支持NLRP6炎癥小體對腸道菌群具有調節作用的動物實驗證據較多。Elinav等[4]研究顯示，NLRP6炎癥小體缺陷小鼠(Nlrp6-/-小鼠、Asc-/-小鼠、caspase-1-/-小鼠)糞便菌群中普氏菌屬和TM7菌屬增加，乳桿菌和厚壁菌門減少；與WT小鼠相比，NLRP6炎癥小體缺陷小鼠表現出更嚴重的右旋糖酐硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導結腸炎、腸道IL-18水平下降；此外，與單獨飼養WT小鼠相比，與NLRP6炎癥小體缺陷小鼠共飼養的WT小鼠表現出更嚴重的DSS結腸炎，而共飼養后WT小鼠的糞便菌群與NLRP6炎癥小體缺陷小鼠類似，故推測WT小鼠DSS結腸炎的加重可能與腸道菌群的轉變相關，且NLRP6對腸道菌群的影響由IL-18介導，菌群失調導致CC類趨化因子配體5表達上調，募集更多免疫細胞，從而導致自發性腸道炎癥。此外，與WT小鼠相比，Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠的炎癥相關結直腸癌更嚴重，菌群失調導致的 CC類趨化因子配體5增加亦有參與，可激活IL-6旁路，從而促進上皮細胞增殖[12]；與單獨飼養WT小鼠相比，與Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠共飼養WT小鼠的膽堿缺乏飲食誘導的非酒精性脂肪性肝炎更嚴重，肝臟中多種炎癥細胞顯著增加[13]。另有研究顯示，共飼養并不能使其他小鼠腸道菌群與Nlrp6-/-小鼠相近，但Nlrp6-/-小鼠存在菌群失調，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加尤其明顯，菌群失調是DSS結腸炎加重的基礎[14]。由此可見，NLRP6炎癥小體對腸道菌群的組成有重要影響，具有減輕腸道炎癥的作用。

但有研究發現，Nlrp6-/-小鼠對單核李斯特菌、鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌的易感性減弱，感染上述菌群的Nlrp6-/-小鼠外周血中性粒細胞及單核細胞數量增加，核因子κB和絲裂原活化蛋白激酶依賴的炎癥因子和趨化因子水平更高[15]。最近的研究亦顯示，Nlrp6-/-小鼠對單核李斯特菌的易感性減弱，單核李斯特菌產生的脂磷壁酸(由革蘭陽性細菌產生)可結合NLRP6的C端富含亮氨酸的重復序列，并激活NLRP6；當WT小鼠感染單核李斯特菌時，NLRP6與caspase-1、caspase-11形成復合物，促進巨噬細胞分泌IL-1β、IL-18；注射IL-18的Nlrp6-/-小鼠對單核李斯特菌的易感性增加，因此推測單核李斯特菌感染加重與巨噬細胞分泌IL-18有關，表明NLRP6炎癥小體可能對某些細菌感染有不利影響[16]。

近年來，通過對實驗研究條件更嚴格的限定進一步加深了對NLRP6炎癥小體調節腸道菌群作用的認識。Lemire等[17]研究發現，同窩出生WT小鼠與Nlrp6-/-小鼠(來源于Nlrp6+/-小鼠)的腸道菌群無明顯差異，且經DSS處理后的結腸長度、結腸組織病理學、IL-18分泌情況亦無顯著差異，僅表現為雌性Nlrp6-/-小鼠體重下降更快，故認為NLRP6 炎癥小體并不能調節腸道菌群，但這一結論對問題進行了過度的簡化，這種情況下還應想到是否可能在環境中存在促發菌群失調的病原菌[18]。Galvez等[19]研究發現，遺傳和環境因素對菌群的影響超過基因表型的影響，且NLRP6對菌群組成的影響主要發生在病原菌入侵后，當機體處于穩態且在無特定病原體環境中飼養時，WT小鼠和Nlrp6-/-小鼠菌群無明顯差異。據此推測，在黏膜破損等疾病狀態下(如炎癥性腸病)，腸道菌群的改變可能導致NLRP6炎癥小體活化，進而調節菌群結構，但無疾病狀態下的NLRP6炎癥小體并不干預菌群結構。

2.2NLPR6炎癥小體與腸道病毒的相互作用Nlrp6-/-小鼠對腸道RNA病毒亦存在易感性，如腦心肌炎病毒和小鼠諾如病毒。NLRP6通過非炎癥依賴機制發揮抗RNA病毒作用，腸道上皮細胞的NLRP6 通過與RNA解旋酶Dhx15形成復合體結合病毒RNA，并激發線粒體抗病毒信號蛋白依賴的抗病毒途徑，促進 Ⅰ 型干擾素的表達，進而產生抗病毒作用[20]。

2.3NLRP6炎癥小體對腸道屏障的影響 腸屏障對維持宿主內環境穩態具有重要作用，腸道黏液、免疫球蛋白A、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、免疫細胞等均參與腸道菌群與宿主免疫系統的相互作用[21]。屏障功能受損可能導致細菌脂多糖入血，出現代謝性內毒素血癥，導致機體處于低度炎癥狀態，并可出現代謝綜合征，如肥胖、心血管疾病、胰島素抵抗[22-23]。

腸屏障可分為化學屏障和物理屏障，前者包括AMPs，后者包括黏液層、單層腸上皮細胞和細胞間的緊密連接。腸道黏液層是抵御病原體入侵、保護上皮免受物理刺激的第一道屏障，其中發揮關鍵生理作用的成分為黏蛋白；結腸黏液層包括外層黏液層(結構松散，其中包含菌群)以及內層黏液層(緊附于上皮層，密布黏蛋白，可抵御細菌)；小腸黏液層缺乏明確的內外層分界[24]。腸上皮的杯狀細胞可產生黏蛋白顆粒并分泌入腸腔形成黏液層。NLRP6炎癥小體可通過影響腸道黏液層、腸道AMPs、結腸黏膜修復來影響腸屏障功能。

2.3.1NLRP6炎癥小體對腸道黏液層的影響 NLRP6炎癥小體可能影響腸道黏液層的形成。 Wlodarska等[25]的研究顯示，杯狀細胞中存在NLRP6 表達，且Nlrp6-/-小鼠存在黏液顆粒釋放障礙，提示NLRP6可能參與黏液屏障的形成；Nlrp6-/-、Asc-/-或caspase-1-/-小鼠腸道未形成厚實連續的內黏液層，而IL-18-/-小鼠腸道黏液層正常形成，表明黏液分泌需要NLRP6炎癥小體的介導，但不依賴NLRP6炎癥小體下游的炎癥因子IL-18。此外，Wlodarska等[25]的研究發現，NLRP6缺乏可影響杯狀細胞中自噬體的形成。既往研究顯示，自噬對于潘氏細胞、破骨細胞和肥大細胞的分泌功能至關重要，故認為 NLPR6 可通過影響杯狀細胞自噬而影響黏液分泌[26-28]。Birchenough等[29]的研究識別了一種位于結腸隱窩入口處的“哨兵”杯狀細胞，這種細胞可通過激活TLR-髓樣分化因子88依賴的Nox/Duox活性氧合成下游的NLRP6炎癥小體，非特異性地吞噬TLR2/1、TLR4及TLR5配體并與之反應，激發鈣離子依賴的MUC2分泌途徑，并形成細胞間信號，促使隱窩上部鄰近杯狀細胞分泌MUC2抵御細菌，且不依賴IL-18。與NLRP6炎癥小體對菌群的調節類似，“哨兵”杯狀細胞依賴NLRP6炎癥小體調節黏液層的途徑只在細菌入侵機體時發揮作用。

2.3.2NLRP6炎癥小體對腸道AMPs的影響 NLRP6炎癥小體對AMPs的分泌亦有調節作用。AMPs主要由潘氏細胞和腸上皮細胞產生，包括 α防御素、β防御素、C型凝集素等，不同抗菌肽可針對不同菌群產生抗菌活性，對腸道菌群具有調節作用[30]。AMPs中內凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4的分泌受IL-18誘導，在無菌小鼠中基本無內凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4表達，Nlrp6-/-小鼠和Asc-/-小鼠的內凝集素1、抵抗素樣分子β、血管生成素4表達降低，提示這些抗菌肽的產生依賴于腸道菌群刺激NLPR6炎癥小體產生的IL-18[8]。

2.3.3NLRP6炎癥小體對結腸黏膜修復的影響 DSS誘導小鼠結腸炎建模過程中結腸NLRP6表達顯著降低，停用DSS后NLRP6表達逐漸增加，且結腸黏膜活檢后Nlrp6-/-小鼠的局部損傷修復速度較WT小鼠明顯減慢，表明NLRP6可促進黏膜修復[5]。NLRP6炎癥小體對黏膜修復的促進可能與IL-18相關；IL-22在結腸上皮細胞的修復過程中有重要作用，IL-22結合蛋白可使IL-22失效，而 NLRP6 炎癥小體可通過IL-18依賴的途徑下調IL-22 結合蛋白水平[31]。此外，NLRP6對DSS相關結腸炎的保護作用還與Ly6Chi炎癥單核細胞相關，DSS誘導結腸炎存在Ly6Chi炎癥單核細胞浸潤，其中NLRP6表達上調，將WT小鼠的Ly6Chi炎癥單核細胞轉移給Nlrp6-/-小鼠，后者腸屏障功能顯著好轉、腸道損傷顯著減輕[32]。另有研究發現，Nlrp6-/-小鼠結腸損傷部位周圍的上皮細胞增殖更明顯，與細胞增殖有關的分子酪蛋白激酶1ε和SMARCC1(SWI/SNF家族成員)的轉錄水平亦提高，提示缺乏NLRP6可能導致結腸黏膜損傷后的病理性增殖，并與結腸炎相關結腸癌的發生有關[5]。

2.4NLRP6炎癥小體在腸道疾病中的作用 腸道中NLRP6炎癥小體的重要作用已引起研究者的廣泛關注。現已發現，某些腸道疾病中存在腸道NLRP6 的異常表達，如先天性巨結腸患者結腸NLRP6 表達顯著下降[33]；炎癥腸病患者結腸 NLRP6 表達隨病情活動度的增加而升高[34]；Chen等[35]發現，NLRP6缺陷小鼠對結腸炎相關癌變的易感性增強，這與血清和結腸IL-18水平下降有關；Zhao等[36]發現，腸易激綜合征模型小鼠結腸NLRP6的表達低于正常小鼠，丁酸梭菌通過對NLRP6 的作用抑制結腸黏膜低度炎，可能對腸易激綜合征的內臟超敏反應發揮有益作用。

目前與NLRP6相關的絕大多數研究為動物實驗，相關人體的研究較少，某些動物實驗結論可能與人體并不符合，因此應謹慎看待動物實驗發現的一些機制和結論。如動物實驗顯示NLRP6與結直腸癌相關，但結直腸癌患者腫瘤組織和癌旁2 cm以上正常結腸黏膜的NLRP6 RNA轉錄水平差異無統計學意義[37]。NLRP6炎癥小體對腸道菌群及腸道屏障均有調節作用，故需進一步探究其在腸道炎癥性疾病、腸道腫瘤、肝膽系疾病、代謝綜合征等疾病中的作用。此外，NLRP6炎癥小體的活化亦與促腎上腺皮質激素釋放激素相關，而下丘腦-垂體-腎上腺軸在腦-腸互動中有重要作用，因此NLRP6炎癥小體與應激相關疾病(如腸易激綜合征)的關系也需要進一步的研究。

3 結 語

NLRP6炎癥小體與腸道微生物間存在相互作用，腸道菌群、病毒對NLRP6炎癥小體有激活作用。當病原菌侵入腸屏障時，NLRP6炎癥小體可發揮調節腸道菌群的作用，NLRP6炎癥小體亦可結合病毒RNA、促進干擾素基因表達；此外，NLRP6 炎癥小體還可促進腸道黏液的分泌，部分抗菌肽的產生也依賴于NLRP6炎癥小體。腸黏膜損傷后，NLRP6炎癥小體可促進黏膜修復，同時抑制修復過程中的病理性增殖。動物實驗是疾病機制探究的重要工具，目前DSS誘導結腸炎模型在NLRP6炎癥小體相關研究中的應用較多，今后可考慮應用其他疾病動物模型進行相對廣泛的動物實驗。目前，關于NLRP6炎癥小體對腸道菌群調節的研究結論并不完全一致，腸道菌群與遺傳、性別、年齡、飲食、環境、應激等多種因素密切相關，故應注意控制研究中的干擾因素，以得到更為可靠的結論。