間充質干細胞來源的外泌體在血管損傷修復中的研究進展

李禹兵，高 凌，羅 登

(武漢大學人民醫院內分泌科，武漢 430060)

最初認為，間充質干細胞能聚集到組織損傷處，但在組織損傷處間充質干細胞并不穩定且分化較低，大部分移植的間充質干細胞出現了細胞凋亡，未直接參與組織再生[1-2]。有證據表明，間充質干細胞使組織再生和修復的主要機制可能為旁分泌作用[3]。而外泌體是間充質干細胞旁分泌作用的主要物質。研究表明，間充質干細胞來源的外泌體(mesenchymal stem cell-derived exosomes，MSC-EXO)能抗心肌細胞凋亡，使心肌梗死面積縮小[4]。在腎缺血再灌注損傷模型中，MSC-EXO可以通過抑制纖維化、抗炎、減輕氧化應激及促進血管新生作用來保護腎臟功能[5]。且已有學者發現，來源于脂肪間充質干細胞的外泌體具有減輕肝臟缺血再灌注損傷的功能，具體作用機制為維持肝血流量、改善血管內皮功能、抗炎癥反應、抑制氧化應激及抗凋亡作用[6]。研究發現，MSC-EXO可與肝細胞結合，使肝細胞分泌生長因子促進肝細胞再生[7-8]。在四氯化碳肝損傷模型中，MSC-EXO能夠抑制肝細胞凋亡[9]。目前，MSC-EXO在不同組織再生中的應用包括：心血管再生，腎臟損傷修復，肝臟損傷修復，骨、軟骨及骨骼肌再生，神經組織再生，口腔組織再生和皮膚創口愈合[10]。其中，血管損傷的修復在組織再生中具有關鍵作用。研究表明，MSC-EXO能改善血管損傷并促進血管再生[11]。現就MSC-EXO在血管損傷修復中的作用機制和應用前景予以綜述。

1 外泌體的概念及其生物學特性

外泌體是由細胞內多囊泡體分泌的直徑為30～200 nm的亞細胞雙層膜囊泡。幾乎所有類型的細胞均可分泌外泌體，包括干細胞，并存在于大多數體液(尿液、血液、唾液、腦脊液及腹水)中[12]。外泌體大致分泌過程為：細胞內多囊泡體通過細胞膜的內陷形成并選擇性地加載含有蛋白質、信使RNA和微RNAs(microRNAs，miRNAs)的胞內體。當多囊泡體與細胞膜融合時，多囊泡體將這些胞內體釋放成為細胞外泌體，而微囊泡(200～1 000 nm)可直接通過細胞膜以胞吐形式釋放[13]。外泌體介導細胞間的信息交流。外泌體與受體細胞結合，可通過一系列信號轉導作用，調控受體細胞的生理功能，并通過向受體細胞轉移多種生物活性分子發揮生物學特性[14]。與脂質體類似，外泌體作為藥物運載工具受到廣泛關注：①納米大小的外泌體可以很容易地在細胞間轉移。②外泌體的脂質雙層膜結構為生物活性分子在細胞外環境中的降解提供了一個受保護的環境[15]。③外泌體的免疫原性和毒性較其他給藥策略低[16]。④具有特定表面蛋白(整合素)的外泌體，可定向到特定的器官[17]。這表明，外泌體是可以用于向損傷組織遞送治療藥物、干擾小RNA或蛋白質的良好載體。

研究表明，在抗癌治療中，外泌體可以作為潛在的藥物運載工具或無細胞疫苗[18]。因此，在臨床和轉化醫學中，外泌體的應用將會越來越廣泛，相比干細胞的移植治療有明顯優勢，如外泌體不促進腫瘤發展，無不良反應(免疫排斥反應、發熱、過敏反應和溶血反應)。另外，外泌體攜帶的蛋白質可發揮更好的治療效果[19]，將來也許會徹底代替間充質干細胞。

2 MSC-EXO在血管損傷修復中的作用機制

2.1抑制血管炎癥反應 血管炎癥反應促進了血管功能障礙的發生、發展，而炎癥因子在血管炎癥反應中起關鍵作用。如腫瘤壞死因子是由內皮細胞及多種炎癥細胞產生的一種炎癥因子，當與血管內皮細胞受體結合時，可經細胞毒性作用導致血管內皮細胞破壞壞死，進而引起血管內皮功能障礙[20]。另一種前炎癥細胞因子白細胞介素-1β能激活多種炎癥細胞，并誘導內皮細胞表達細胞間黏附分子-1和E選擇素等內皮黏附分子，促進血液內白細胞黏著于血管內皮細胞表面，加重炎癥反應，釋放細胞毒性物質，從而產生血管損傷。研究表明，MSC-EXO能顯著降低腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的表達水平，上調抗炎因子(白細胞介素-10)表達，并顯著促進血管生成[21]。此外，MSC-EXO還可減少炎癥細胞的浸潤，減少趨化因子分泌，從而降低炎癥反應[22]。研究發現，MSC-EXO可抑制炎癥因子和肺內巨噬細胞流所引起的肺血管炎癥反應[23]。且MSC-EXO中的miRNAs在抗炎癥反應中也起重要作用，MSC-EXO攜帶和分泌的miR-181，可通過核因子κB信號通路抑制血管炎癥反應[24-25]。因此，MSC-EXO可通過調節炎癥因子水平、減少炎癥細胞浸潤和釋放多種miRNAs來抑制血管炎癥反應，從而對血管損傷的修復起重要作用。

2.2抗氧化應激 氧化應激是血管損傷的機制之一。炎癥反應和氧化應激可相互促進其發展，從而形成惡性循環，共同促進血管損傷的發生和發展。當發生血管炎癥反應時，血管內皮細胞和平滑肌細胞均可分泌超氧陰離子，同時浸潤的白細胞可經還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶產生多種活性氧類；此外，巨噬細胞分泌的促炎癥因子可增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶活性，促進活性氧類的產生，引起活性氧分子和活性氧自由基增加，最終導致氧化應激，血管內皮細胞和平滑肌細胞凋亡，從而引起血管損傷。研究發現，miR-214-鈣調蛋白依賴蛋白激酶Ⅱ軸可調控心臟干細胞氧化應激相關損傷，如細胞凋亡、鈣穩態失衡和過量的活性氧產生，而應用MSC-EXO能顯著降低心臟干細胞氧化應激損傷后的細胞凋亡率和減少活性氧的產生；且該研究證實，外泌體中的miR-214是MSC-EXO保護心臟干細胞免受氧化應激損傷的主要效應分子[26]。此外，有研究表明內皮祖細胞來源的外泌體可使活性氧的生成減少,從而抑制氧化應激，維持血管內皮細胞功能[27]。動脈粥樣硬化是一種慢性進行性血管破壞性疾病，研究表明干細胞分泌的外泌體能抗氧化應激，阻礙動脈粥樣硬化的惡性發展[28]。因此，MSC-EXO也可通過抗氧化應激，減少細胞凋亡，修復血管損傷。

2.3抑制細胞凋亡 血管平滑肌細胞增殖與凋亡的失衡是血管損傷的原因之一。如長期血管炎癥反應會引起血管平滑肌細胞過度凋亡及主動脈中膜厚度變薄和直徑變大，最終導致胸主動脈瘤的形成。Cabal-Hierro和Lazo[29]研究表明，MSC-EXO可通過抑制腫瘤壞死因子受體相關因子6 減少細胞凋亡。在缺血心肌中，學者發現心臟祖細胞分泌的外泌體能抑制心肌細胞凋亡和促進血管生成[30]。MSC-EXO可轉運多種RNA(信使RNA、miRNAs)到靶細胞，如miR-504、miR-23等，同時誘導靶細胞分泌一些因子，如肝細胞生長因子和血管內皮生長因子等，最終抑制細胞凋亡和促進細胞增殖[31]。有研究表明，miRNAs具有調控細胞增殖、生長、凋亡和分化等多種生物學功能[32]。而血管平滑肌細胞的增殖和凋亡受miRNAs調控。其中，miR-504過表達可通過調控抑癌基因p53的表達促進血管平滑肌細胞的增殖和抑制其凋亡[33]。miR-23通過降低促凋亡蛋白(Bcl-2相關X蛋白)和胱天蛋白酶3水平抑制血管平滑肌細胞凋亡和促進血管平滑肌細胞的增殖[34]。此外，心臟干細胞來源的外泌體可以裝載miR-210，miR-210被轉移到心肌細胞中，抑制心肌細胞的凋亡[35]。Bian等[36]發現，MSC-EXO能顯著縮小急性心肌梗死兔模型中的心肌梗死面積，促進新生血管形成，并改善心功能。在急性腎損傷小鼠的模型中，學者發現MSC-EXO能通過抑制細胞凋亡和促進細胞增殖，保護腎功能[37]。可見，控制血管平滑細胞凋亡和增殖的平衡有助于血管損傷的修復，而MSC-EXO在其中具有重要的調控作用。

2.4促進血管新生 血管新生障礙是血管損傷修復延遲的主要原因，會造成血管供血不足，從而引起組織、器官損傷修復障礙。有學者發現，源自人脂肪間充質干細胞的外泌體可以被血管內皮細胞攝取，并能促進血管新生[38]。外泌體中含有豐富的miR-125a，miR-125a在血管形成過程中具有重要作用，可以減少PLL4的表達，促進血管形成。將miR-125a基因敲除后，外泌體的促血管新生作用則被明顯抑制[39]。另有研究發現，在小鼠全層皮膚缺損的動物模型中，外泌體有助于缺損處的血管新生和成熟[40]。且從多種細胞培養上清中提取的外泌體可通過促進血管新生，提高皮膚組織的修復、創面愈合能力。此外，人尿源干細胞來源的外泌體可促進臍靜脈內皮細胞的遷移、增殖和血管的形成，同時促進大鼠皮膚切口的血管增生，促使受損皮膚組織的修復與再生[41]。由于血管新生在血管損傷的修復中起重要作用，所以MSC-EXO也可通過促血管新生作用促進血管損傷的修復。

2.5抗血管重構 血管重構是發生血管損傷的重要原因，是基于血流動力學改變所引起的血管自適應性反應，涉及細胞的增殖、肥大、凋亡和遷移，以及細胞外基質的產生和降解失衡。肺動脈高壓是血管損傷中常見的血管疾病，其主要由于長期缺氧導致肺血管重構而逐漸形成。文獻報道，間充質干細胞可通過旁分泌活動分泌外泌體來抑制Smad2的磷酸化，發揮抗肺血管重構作用，從而抑制低氧誘導的小鼠肺動脈高壓的形成和發展[42]。腹主動脈瘤是以炎癥、巨噬細胞浸潤和血管重構為特征的嚴重退行性血管疾病。研究發現，MSC-EXO可通過miR-147的抗血管重構作用抑制腹主動脈瘤形成[43]。另有研究顯示，MSC-EXO通過miR-204在抗血管重構中起重要作用[23]。但是，MSC-EXO抗血管重構效應的分子機制有待進一步研究。

2.6調節巨噬細胞極化 動脈粥樣硬化是一種全身性的慢性炎癥性血管疾病，其可能涉及所有動脈內膜并引起血管硬化和狹窄，最終導致心腦血管意外和血栓栓塞性疾病[44]。目前，動脈粥樣硬化仍是冠狀動脈病變的主要原因[45]。而巨噬細胞產生的許多炎癥細胞因子在動脈粥樣硬化的病變過程中起促進作用[46]。巨噬細胞主要分化為兩種不同功能的表型：M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞，分別發揮促炎和抗炎作用。雖然M2型巨噬細胞在早期動脈粥樣硬化斑塊中占主要部分，但隨著斑塊進展，M2型巨噬細胞會向M1型巨噬細胞轉化。M1型巨噬細胞產生的炎癥因子，與斑塊的不穩定及發生、惡化有關[47]。而M2 型巨噬細胞分泌的白細胞介素-10、抗炎細胞因子轉化生長因子-β具有穩定斑塊和抗動脈粥樣硬化的效果。因此，調節巨噬細胞極化有利于抗血管粥樣硬化。此外，骨髓間充質干細胞的應用可抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展[48]。研究證明，間充質干細胞移植能減小高脂喂養載脂蛋白E基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化斑塊面積，但具體作用機制尚不清楚[49]。且MSC-EXO可通過miR-let7/高遷移率族蛋白A2/核因子κB途徑促進M2型巨噬細胞極化和通過miR-let7/胰島素樣生長因子2 mRNA結合蛋白1/人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因途徑抑制巨噬細胞在斑塊中的浸潤共同作用來改善載脂蛋白E基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化，其中調節巨噬細胞極化起主要作用[50]。這一發現拓展了大家對MSC-EXO影響動脈粥樣硬化斑塊炎癥的認識，并為預防動脈粥樣硬化提供了一種潛在方法。因此，MSC-EXO有望作為治療藥物，降低冠心病的發生風險。

3 小 結

血管損傷主要由血管炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、血管新生障礙、血管重構和巨噬細胞極化共同作用引起。不同組織的損傷修復和再生均涉及到血管再生，而MSC-EXO具有抑制血管炎癥反應、抗細胞凋亡、抑制氧化應激、促進血管新生、抗血管和調節巨噬細胞極化的功能，因此其在血管損傷修復中具有重要作用。胸主動脈瘤是危重的退行性血管疾病，直徑為60 mm的胸主動脈瘤具有極大的破裂風險，主動脈瘤一旦破裂，死亡率將高達80%[51]。目前，其臨床治療方式主要為外科手術，但手術死亡率極高。雖然血管內動脈瘤修補術和胸段動脈瘤修補術均是微創的介入治療方法，但它們存在著內膜和移植物遷移等缺點。因此，需要一種新的方法來替代胸主動瘤的治療，以降低手術破裂的風險及代替干細胞治療。而MSC-EXO獨特的生物學效應，使其能為治療胸主動脈瘤提供新策略，未來可深入研究。