4D生物打印技術的研究進展

白凱淞，陳光華，由長城，閆景龍

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院骨外科，哈爾濱 150001)

再生醫學是醫學的一個分支，包括組織工程、治療性干細胞及人造器官的運用[1]。其中，組織工程可制造用于修復受損或病變組織的人造組織[2]。3D打印技術于1986年由赫爾公司獲得專利，此后研究者們開發了大量的3D打印技術[3]。在構建非生物支架和細胞的復雜聚合結構時，最有效的方法為3D打印和3D生物打印，前者是在非生命物質上進行計算機輔助構建，后者即3D打印生命體[4]。然而，目前3D打印/生物打印技術具有很多局限性，如在打印體分辨率、生物兼容性、細胞活性及機械性能等方面無法兼顧[5-6]。4D生物打印技術是近年來發展起來的一種技術，可以使人造組織具有環境響應性[7]。4D生物打印技術包含了利用形態轉化的各種生物制造方法，如溶劑澆鑄、旋涂/浸涂、光刻等。該技術的根本思路是先制作一個3D結構，然后改變它的形態。這種形態轉化與物體的三維空間維度(x,y,z)的額外維度(時間)有關[8]。此技術可以彌補3D生物打印的不足，從而更準確地模擬原生組織的動態變化。現就4D生物打印技術的研究進展予以綜述。

1 形態轉化方法

改變制造體形態的方法有很多，可以人工完成，也可使用具有變形特性的材料，現分別介紹如下。

1.1自發形態轉化 利用材料內應力引起自發形態轉化是4D生物打印技術的一種主要方法。如由不同性質的金屬及其氧化物構成的無機雙層晶體，通常具有因晶格失配而產生的內應力，從而引起形態轉化[9-10]。利用材料內應力引起自發形態轉化的優點為可通過折疊由光刻法制備的零件來制造微小三維結構，而缺點為結構在制造后會直接發生形態轉化，即須將細胞填充于已發生完全形變的結構中，無法利用形態轉化來制造三維細胞結構，且金屬及其氧化物通常無法生物降解，故限制了其應用。而使用水凝膠可解決金屬及其氧化物無法生物降解的問題[11]。如Jamal等[12]研究發現，聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)雙分子層可發生自發形變，因其兩層具有不同的溶脹系數。利用PEG雙分子層自發形變可將細胞封裝于水凝膠內，但難以通過外界信號引發形態轉化。由于PEG鏈可將生物降解的酯基連接到主聚合物鏈上，故認為這種聚合物也是可生物降解的，但不會降解為單體，而是降解為單獨的水溶性聚合物鏈。

通常，所有基于自發形態轉化方法的缺點為難以控制打印體折疊。

1.2使用環境響應性材料控制形態轉化 控制物體形態轉化最復雜但最有前景的方法為使用環境響應性材料[13]。其優點包括：①可以更好地控制形態轉化；②可以同時折疊多個物體；③可以折疊更微小的結構。在4D生物打印中，使用環境響應性材料與自發形態轉化法中使用內應力材料的概念非常相似，但不同的是，使用環境響應性材料可以通過控制環境刺激精確控制產生或釋放內應力及形態轉化的時間，而材料內應力無法被精確控制。這些優點為環境響應性材料在4D生物打印中的應用提供了廣闊的發展空間。

雖然環境響應性材料有很多，但刺激條件卻有很大限制[14]。如pH改變或紫外線會對細胞活性造成影響，這種刺激不可取[15]。有學者通過研究發現，可調節而又不影響細胞活性的條件為溫度(4～40 ℃)[16]、Ca2+水平[17]、磁場[18]及聲波[19]等。

1.2.1溫度敏感型水凝膠 具有可變溶脹性質的溫敏聚合物可用于制作水凝膠。在最早關于生物制造中應用環境響應性聚合物的報道中，聚N-異丙基丙烯酰胺[20]就已經被使用。基于此聚合物制作的水凝膠表現出低臨界相轉變溫度的特性，即在低溫下，聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠在水中溶脹，并隨溫度升高而收縮。這種特性已被用于制造雙層結構，此結構可分別在低溫和高溫下進行可逆折疊或展開，并被用于細胞封裝[21]。雖然基于聚N-異丙基丙烯酰胺的溫敏水凝膠為4D生物打印提供了廣泛的可能性，但它卻有致命的缺點——聚合物疏水，無法生物降解，且在溫度升高時生物相容性變差。

近年來，美國食品藥品管理局批準可以將聚乳酸-羥基乙酸[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]用于臨床試驗。因此，PLGA/PEG/PLGA三嵌段共聚物(PLGAm-PEGn-PLGAm，其中m與n值分別代表PLGA與PEG的分子量)溫敏水凝膠受到研究者們的重視，其降解產物PLGA與PEG可完全生物降解[22-23]。這種聚合物具有反向溶膠-凝膠的特性，即在低溫時溶膠，在體溫時凝膠，已應用于遞送藥物[23]。它可以在低溫時被注射入體內某處，在體溫下便可發生形態轉化，且凝膠后可形成多孔型結構，有利于細胞代謝[24]。

1.2.2Ca2+敏感型水凝膠 Kirillova等[17]制作出一種藻酸鹽/透明質酸凝膠，該凝膠具有環境響應性，且可封裝細胞。這種凝膠是具有羧基的多糖，且它的溶脹性質取決于溶液中多價離子(Ca2+)的水平。同時該研究表明，細胞可以耐受細胞外環境中Ca2+水平的變化，Ca2+可作為一種具有“生物相容性”的刺激條件來誘導形態轉化。基于以上研究結果，他們將甲基丙烯酸酯化聚合物及光引發劑與細胞一同打印出來，并用可見光照射它們以形成水凝膠。這種甲基丙烯酸酯化聚合物頂層在交聯過程中開始干燥，導致頂層和底層的交聯密度不同，從而引起水凝膠與無Ca2+細胞培養基中的細胞折疊，而改變Ca2+水平會使其展開。通過控制Ca2+水平來控制形態轉化是4D生物打印最有前景的方法之一，因為Ca2+敏感型水凝膠可以與生物打印結合使用，可生物降解及生物相容，且可以將細胞附著于聚合物表面或封裝于內部。

1.2.3磁響應材料 磁響應材料由磁性微粒子或納米粒子組成，包括能響應于磁場的鐵磁性粒子及順磁性粒子。Zhang等[18]將介孔Fe3O4納米顆粒與PEG組合形成磁響應材料，可用于控制多柔比星的釋放。其中，一些磁響應材料已用于3D打印的墨水中。Tasoglu等[25]研究表明，PEG水凝膠是在磁場作用下通過自由基順磁性在凝膠中組裝而成。同時，他們將明膠甲基丙烯酰或載有細胞的明膠甲基丙烯酰浸沒在穩定的自由基溶液中，使水凝膠順磁化，從而可以在磁場的影響下進行形態轉化。此外，維生素E可作為自由基清除劑，降低凝膠的磁性[26]。這種磁場響應行為模式可用于4D生物打印中，并可以安全和快速的方式操縱載有細胞的打印體。

1.2.4聲響應材料 聲波可能會引起材料進行物理或化學變化，特別是在高能量下[19]。Naseer等[19]研究表明，可利用聲波以準確、快速和非接觸的方式對細胞進行圖案化來進行形態轉化。且聲波也已用于在時間與空間上控制水凝膠藥物釋放。如Huebsch等[27]開發了一種基于藻酸鹽的聲敏水凝膠。這種聲敏水凝膠有作為4D生物打印生物墨水的潛力，因為藻酸鹽已被廣泛用作3D生物打印墨水材料[28]。可見，由聲敏生物墨水制成的4D生物打印結構能以安全無創的方式進行形態轉化。

1.2.5形狀記憶聚合物 形狀記憶聚合物是一種通過化學或物理方法交聯，并在變形狀態下被冷卻到熔點或玻璃化轉變溫度以下，且可以生物降解的新型材料[29]。當溫度升高到熔點或玻璃化轉變溫度以上時，形狀記憶聚合物就會變形，且可以進行非常復雜的折疊[30]。固體形狀記憶聚合物的缺點是細胞只能附著于表面而無法封裝于內部。這個問題或許可以通過使用形狀記憶水凝膠來解決，但目前仍無使用形狀記憶水凝膠來進行生物制造的實例。在使用形狀記憶聚合物進行4D生物打印時，主要的缺點為需要進行人工形態轉化，如果樣品體積很小，將會非常困難[29]。

1.2.6具有溶膠-凝膠轉變特性的材料 使用凝膠的溶膠-凝膠轉變特性來控制形態轉化是4D生物打印極具前景的方法之一[16]。明膠是通過膠原水解獲得的天然聚合物。交聯明膠的溶脹性質與溫度無關，但其水溶液具有在30～37 ℃發生溶膠-凝膠轉變的特性。即明膠在冷水中溶脹但在溫水中溶解，這種特性可用于觸發形態轉化。Stroganov等[16]在明膠-聚己內酯雙層的實例中證實了這種效果。先將明膠-聚己內酯雙層結構于冷水中進行不可逆折疊，再用紫外線光通過光掩模照射，使明膠-聚己內酯雙層聚合物在某些位置發生交聯。通過有機溶劑漂洗除去非交聯聚己內酯，而未交聯明膠被保留。將這種雙層結構浸入冷水，交聯和非交聯明膠會發生溶脹。此時，非交聯明膠會維系雙層結構并防止其折疊，由于結構穩定，細胞可被附著于雙層結構上。當溫度升高至33 ℃時，非交聯明膠會發生溶解，從而導致雙層結構發生形態轉化。該方法的優點是可以使用任何具有溶膠-凝膠轉變特性的聚合物代替明膠，用任何疏水聚合物和水凝膠代替聚己內酯。

1.3細胞收縮介導的形態轉化 附著在基質上的細胞能夠產生牽引力。Kuribayashi-Shigetomi等[31]通過控制細胞牽引力來制造自折疊細胞結構。首先制作由柔性接頭相互連接的微型板，再將細胞種植在微型板上。細胞通過其牽引力使柔性接頭發生形變，從而使微型板折疊。控制折疊不依賴于微型板上的細胞數量，而是通過控制柔性接頭的寬度與厚度精確地控制折疊。增加寬度可增大折疊角度，增加厚度可提高接頭的強度，當接頭厚度超過一定程度時，細胞牽引力不足以折疊此接頭，所以可通過調節接頭厚度來控制折疊。這種方法的優點是用細胞來控制材料折疊，更符合細胞生物學行為，且材料選擇廣泛度高。但缺點為折疊必須依賴于細胞生物學行為，須兼顧形態轉化和細胞行為，限制了其應用自由度。

1.4人工形態轉化 改變物體形態最簡單的方法是人工形態轉化，但此方法是否可以被歸類于 4D生物打印技術，目前尚存在爭議。有研究表明，可以手動將細胞膜片[32]或有細胞吸附的聚合物薄膜[33]纏繞在一種棒狀結構周圍來制造管狀結構，棒狀結構可以由玻璃、聚苯乙烯或瓊脂糖制成，移除棒狀結構后即可形成管狀結構。將拉伸橡皮筋作為細胞附著的基質，釋放橡皮筋時它會折疊并形成管狀結構，這是一種更先進的形態轉化方法[34]。而將拉伸橡皮筋應用于含細胞的靜電紡絲膜，是該方法的一種改良。釋放橡皮筋會使靜電紡絲膜發生旋轉形變[35]。人工形態轉化方法的一大優點為它幾乎可以應用于任何類型的材料，缺點為僅可以制造結構簡單且體積較大的物體。

2 4D生物打印形態轉化方式

將形態轉化用于4D生物打印主要有3種方式[36]：①首先制造非生物構建體，再轉化其形態，最后填充細胞于物體表面，類似于傳統支架的制作方法；②首先制造非生物構建，再填充細胞于物體表面，最后轉化形態；③同時構建非生物材料與細胞復合體，即細胞封裝于物體內部，再轉化形態。

其中，活細胞對材料選擇、制造方式，以及形態轉化條件的限制最為苛刻，且非生物材料必須具有良好的生物相容性和細胞黏附性并無毒害。由于第一種方式是在三維物體發生形態轉化后，再將細胞植入其內，所以可用各種加工條件(溫度、極端pH、激光、金屬離子、有機溶劑等)的材料。然而這種方式因為沒有利用形態轉化來制造三維細胞結構，即物體發生形態轉化后，很難實現在物體表面填充以及精確附著不同種類細胞，前景欠佳。在第二種方式中，細胞已附著于形態轉化的材料表面，材料形態轉化可形成三維細胞結構。在此方法中，材料必須具有良好的生物相容性，且形態轉化所需條件必須適合細胞生存。而在填充細胞前，均可以在任何條件下加工和處理變形材料。第三種方式最具挑戰性，是用已封裝細胞的物體進行形態轉化，對材料的制造及形態轉化條件均嚴格限制。且后兩種方式均為使含有活細胞的物體形態轉化，是最有前景的4D生物打印形態轉化方式。而后兩種方式的區別在于，前者細胞附著在物體表面，而后者細胞封裝于物體內部。

3 材料加工方法

與其他制造技術一樣，4D生物打印技術的材料加工方法也可基于減材、增材和等材制造原理。最早的變形材料是用切削加工而成，可以歸于減材制造[37]。隨后出現的光刻技術更加先進，采取多層材料堆積交聯，再去除非交聯材料，即光刻法也可以歸類為減材制造，優點為分辨率高[38]。另一方面，光刻法需要使用特殊的光掩模，制造復雜多層結構需要材料多次循環堆積，再經光掩模照射，最后去除多余材料，這導致在復雜多層結構內部封裝活細胞極其困難，所以光刻法通常應用于形態轉化的第二種方式。等材制造也稱成形制造，如將聚合物溶液在具有特定形狀的孔中干燥以形成特定形狀結構[39]。然而，成形制造對細胞活力影響較大，無法應用于4D生物打印。3D打印具有組合不同材料的優點，并可使用上述3種形態轉化方式，其基于擠出法的打印技術通常用于制造形態轉化結構，而立體光刻法的缺點在于難于組合不同種類的材料[17]。在各種制造方法中，增材制造即3D打印技術的制造靈活性最高。

4 應 用

4D生物打印為生物材料的發展開辟了新道路，目前已用于模擬管狀結構和各種微組織中。

4.1模擬管狀結構 管狀結構是形變物體最重要的結構。管狀結構雖然簡單，但在人體中起著非常重要的作用。人體許多組織器官均有管狀結構，如血管、腺體和皮質骨等。因此，開發制造血管為應用4D生物打印最重要的方向之一[34-35]。多層管狀結構仿制的血管結構可通過手動纏繞或釋放拉伸橡皮筋等方法實現，但目前用此方法制造的結構緊致度不足，無法承受血液壓力。另一個難題為制造血管網，目前只制造了單一直管結構。Kutikov等[33]開發出一種由含細胞電紡膜經人工纏繞設計形成的結構，并描述了它在修復骨缺損中的應用。皮質骨具有同心圓式結構和內部血管，運用人工纏繞法則是模仿皮質骨的結構。而使用常規3D生物打印需要高分辨率，且會降低細胞活性，制造這種結構相當困難[40]。

4.2模擬其他組織 Park等[41]提出了一種利用4D生物打印技術設計人工胰腺的方法。該研究使用形態轉化的方法將胰腺β細胞封裝于一種多孔鎳鉻金屬容器內，方孔大小為8 μm×8 μm，細胞無法通過小孔逃逸，且小孔為細胞的物質運輸提供了自由通道。容器被固定在海藻酸鹽薄片上，然后通過人工滾動形成卷軸式結構。此完整結構能夠釋放胰島素，釋放量由葡萄糖水平控制。同時，4D生物打印還可用于制造各種細胞支架，這種細胞支架可以在適當條件下發生形態轉化。Montgomery等[42]描述了一種形狀記憶支架在功能性組織微創傳輸中的應用，通過1 mm的微孔遞送支架和心臟補片(1 cm×1 cm)，支架與補片可在遞送后恢復其初始形狀，顯著改善心肌功能。

4D生物打印技術雖然剛剛起步，但在組織工程及其他生物醫學領域中具有非常廣闊的應用前景。且這種先進制造理念與智能可變結構可以利用自然力或人為刺激來制造理想結構并達成預期目的。

5 小 結

自1986年起，3D打印技術及3D生物打印技術的發展取得了顯著進步。4D生物打印技術是一種新興且極具前途的組織工程方法。與傳統3D生物打印相比，4D生物打印的主要優點為形成了二維結構(平面層)，并通過形態轉化成為三維結構。制造單層結構無需高分辨率，而直接打印三維管狀結構需高分辨率，且會對細胞活性產生負面影響。同時，將高密度的細胞附著在平面結構的表面很容易，而直接打印含有高密度的細胞的結構非常困難。因此，4D生物打印技術具有許多優勢，它通過使用各種手段，以一種可控的方式，對打印結構進行形態轉化，從而制造理想結構。雖然目前全世界已在 4D生物打印技術方面取得了很大進步，但仍然存在許多難題亟需解決。①在用于4D生物打印的各種材料中，環境響應性水凝膠是最有前景的，但環境響應條件溫和、具有良好的生物相容性及生物降解性的卻非常少。PLGA-PEG-PLGA溫敏水凝膠符合上述條件，已廣泛應用于科學研究及臨床，具有廣闊的應用前景[22-24]。②是形態轉化后的形狀。4D生物打印技術的潛在應用之一是制造血管，但目前僅報道制造出單一直管，尚無制造分支血管網的案例[34-35]，有待于進一步研究。③是打印結構的機械性能。因為打印結構通常不是緊密封閉的，所以不能承受血壓。或許能夠通過改良材料或技術，或者通過細胞分泌細胞外基質來改善機械性能。未來隨著研究的進展和技術的進步，相信4D生物打印技術的應用會越來越廣泛。