自噬在膠質母細胞瘤中的研究進展

趙海杞，趙世光，石長濱，張欣健，韓大勇，滕 雷

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院神經外一科，哈爾濱 150001)

自噬在細菌和病毒感染[1]、抑制炎癥反應、適應性免疫反應和免疫監視以及神經退行性變、心臟病、腫瘤等方面發揮著重要作用[2]。自噬活動異常是一個新發現的腫瘤特征，與腫瘤的發生、生存和治療有關[3]。一般而言，自噬能夠通過清除廢物和管理合成及分解代謝的有毒副產品(如活性氧)減輕細胞在代謝和治療方面的壓力[4]。膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是一種侵襲性強，惡性程度最高的星形細胞腫瘤，是兒童和成人癌癥相關死亡的主要原因之一。自噬具有雙重功能，少量的自噬可以增加GBM細胞的耐藥性，過量的自噬則可以通過自噬性死亡殺傷腫瘤細胞[5]。在GBM中,替莫唑胺(temozolomide，TMZ)誘導的自噬作用被認為是TMZ作用于腫瘤細胞的機制。合理利用自噬在GBM中的作用機制，將有助于有效利用自噬來治療GBM?，F對自噬在GBM發生、發展中的作用及在新型靶向治療領域的相關前景進行綜述。

1 自 噬

1.1自噬的概念 自噬是一種保守的進化過程，細胞通過降解和循環細胞質成分以供細胞再利用[6]。自噬是泛素-蛋白酶體系統的補充，參與大多數蛋白質和細胞器(如線粒體、高爾基復合體和內質網)的降解和再循環[7]。在健康細胞中，自噬通常處于基礎水平，是維持細胞質質量控制和細胞內穩態所必需的[8]。在某些細胞環境中，特別是當細胞凋亡有缺陷時，自噬則可以介導第二種形式的程序性細胞死亡，即自噬性死亡，或者自噬性死亡與凋亡同時發生。自噬是一個多步驟的過程。首先，自噬從形成來源于內質網或線粒體的分離膜開始[9]。分離膜將逐漸囊括部分細胞質，形成一個雙膜自噬體。然后，雙膜自噬體會與溶酶體融合形成自溶體，自溶體可以被溶酶體水解酶降解。最后，降解得到的大分子會被輸送到胞質中被各種代謝回路重復使用。在此過程中，微管相關蛋白LC3-Ⅰ會與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-磷脂酰乙醇胺共軛物。因此，在體外和體內，LC3-磷脂酰乙醇胺共軛物的增加通常被當作自噬誘導產生的指標。通過對酵母進行遺傳分析發現了大量的進化保守基因，即自噬相關基因(autophagy-related gene，Atg)，負責調控自噬體形成的順序-即自噬體膜的起始、成泡和擴展。根據定位于吞噬細胞組裝位點的核心Atg在自噬發生中的不同功能作用，可分為不同的類群，包括：UNC-51樣激酶1復合體；胞內磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)復合體；Atg 9循環系統和Atg 8/微管相關蛋白LC3泛素樣共軛系統等[10]。

1.2自噬的調節機制 自噬起始主要由哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)控制，作用方式是阻斷UNC-51樣激酶1復合體的活性，從而阻止形成自噬體所需的第一步[11]。mTOR有兩種結構不同的復合物，即哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)1和 mTORC2，兩者雖然具有共同的組成成分，但細胞功能并不相同。mTORC1被認為是自噬的主負調節因子[12]。mTOR1的活性由高營養水平、高能量利用率、氧含量正常等多方面因素來維持[13]。隨著這些因素在細胞應激條件下被削弱，自噬體的生成會明顯增加。這些因素主要在mTORC1和mTORC2的復合體上調節這一過程。例如，5′-腺苷酸依賴的蛋白激酶能夠磷酸化mTORC2，該激酶在低腺苷三磷酸水平下被激活，導致mTORC1和mTORC2復合體的激活，抑制了mTORC1的活性，并進一步誘導自噬[14]。PI3K信號通路是在生長因子刺激受體酪氨酸激酶后激活的，也可以直接磷酸化mTORC2，伴隨mTORC1活性激活，抑制自噬[15]。很多信號通路和關鍵細胞蛋白也參與了自噬的調控，包括真核延伸因子-2激酶、應激活化蛋白激酶、核因子κB信號通路等。例如，真核延伸因子-2激酶在調節多個細胞應激(包括內質網應激和氨基酸饑餓)時的自噬中發揮重要作用。應激活化蛋白激酶參與了幾種刺激自噬誘導的途徑，包括內質網應激和腫瘤壞死因子-α引起的應激。此外，應激活化蛋白激酶信號還參與了自噬性細胞死亡和各種Atg表達的調控。研究表明，核因子κB信號通路抑制也是自噬細胞死亡的必要條件[16]?？傊?，自噬是一個復雜的調控過程，包括了大量的相關調節因子。而這些調節因子多為抑癌蛋白或癌基因。因此，與自噬調控有關的通路和與腫瘤相關的信號通路很大程度上是重疊的。

2 自噬在GBM發生發展中的作用

2.1GBM中自噬的發生 GBM是一種侵襲性星形細胞腫瘤。GBM患者的中位生存期為最初診斷后的12～15個月。對新診斷的GBM患者的常規治療方法包括手術切除腫瘤、放療和化療。雖然這些治療方法已將生存率提高到14.6個月，但生存優勢僅為姑息性[17]。自噬可能阻止或抑制GBM發生。在原發的人乳腺癌中存在自噬相關蛋白 Beclin 1的單等位基因缺失，而Beclin 1雜合子缺失與小鼠自發腫瘤的高發生率有關。因此，Beclin 1在腫瘤中的缺失支持了自噬在本病的發生中起抑制作用的理論。與低級別星形細胞瘤和正常腦組織相比，GBM細胞中自噬相關蛋白Beclin 1與LC3b-Ⅱ水平降低，提示自噬活性降低可能導致GBM向更加惡性的方向發展[18]。GBM細胞胞質中Beclin 1的高水平與細胞凋亡呈正相關，與細胞增殖呈負相關。有報道表明，高Beclin 1水平的GBM患者治療后表現的狀態，對治療的客觀反應率較高，疾病短期無進展，且總體生存率較高[19]。

2.2GBM中自噬的調節與功能 自噬的調節是由信號通路控制的，這些信號通路也調節GBM的發生、發展。自噬調節基因Atg4C、Atg5以及Beclin 1的表達缺乏以及PIK3-蛋白激酶B-mTOR信號通路的下調伴隨著GBM的發展[20]。辛二酰苯胺異羥肟酸是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，可以改變染色質結構，從而調節DNA損傷修復[21]。辛二酰苯胺異羥肟酸可以通過下調PIK3-蛋白激酶B-mTOR信號通路來誘導自噬，進一步通過細胞凋亡來促進GBM干細胞的死亡[22]。因此，可調節自噬相關信號通路的化學物質，在GBM中具有治療潛力。自噬在腫瘤中具有雙重功能，在腫瘤發生的早期階段，會限制細胞的增殖，造成DNA的損傷，從而限制腫瘤的進展。當腫瘤體積增大時，其血液供應受到限制，自噬可促進缺乏營養和缺氧的腫瘤區域內腫瘤細胞的存活[23]。當考慮治療耐藥性時，經典化療和自噬調節之間的相互作用是復雜的。已有研究者提出，自噬可能導致腫瘤細存活或細胞死亡，但取決于細胞的環境[24]。一方面，TMZ誘導的自噬作用似乎具有細胞保護作用。TMZ急性治療時可持續抑制類雷帕霉素靶蛋白，產生短暫的自噬作用，導致治療的細胞耐藥性。另一方面，自噬可以增強TMZ對GBM細胞的殺傷作用，研究發現TMZ與沙利度胺聯合作用增強了TMZ對GBM細胞的細胞毒性，沙利度胺被認為是一種影響PI3K信號通路的藥物，具有調節自噬的作用[25]。自噬對GBM的侵襲和抑制具有雙重的調節作用。

2.3GBM中自噬的研究進展 最近根據基因表達預測將GBM分為4種分子亞型(經典型、間充質型、前神經型和神經型)[26]，更多的證據表明，自噬與這種分型高度相關。例如，經典型的GBM的特點是表皮生長因子受體水平異常增高，而神經纖維瘤蛋白-1(neurofibromin 1，NF1)幾乎沒有變化；表皮生長因子受體的這種擴增可以通過維持細胞內的基本葡萄糖水平抑制自噬[27]。表皮生長因子受體的擴增還會導致PI3K信號通路下游出現異常信號，進而促進腫瘤細胞的存活、生長、運動和侵襲，以及血管生成[28]?？梢?，表皮生長因子受體低表達和Beclin 1 高表達可作為GBM預后較好的生物標志。NF1和人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因突變頻率最高。上述結果表明，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因通過抑制PI3K信號通路而上調自噬，而NF1是大鼠肉瘤蛋白的拮抗劑和類雷帕霉素靶蛋白的負調節因子，因此人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因和NF1的共突變也與PI3K-蛋白激酶B-mTOR通路的激活和自噬抑制有關。有研究在間充質型GBM中發現了較高水平的自噬底物蛋白p62，自噬底物蛋白p62積聚可以幫助解釋與此亞型相關的侵襲性[29]。在不同的GBM分子亞型中發現了微管相關蛋白LC3的不同基礎表達水平，這凸顯了自噬在亞型特異性GBM的發生和發展中的潛在意義。然而，為了更好地理解自噬在GBM中的相關性，需要對不同GBM亞型中自噬調節因子的表達進行更詳細的分析。反過來，這也可能有助于發展基于自噬的治療方法，從而提高目前治療標準的有效性。

3 自噬在GBM治療中的作用

在GBM中,TMZ誘導的自噬作用被認為是TMZ作用于腫瘤細胞的機制[30]。TMZ是一種烷基化咪唑四嗪，是GBM化療的主要藥物，在O6位將基因組DNA中的鳥嘌呤甲基化，使得下一個復制周期中，甲基化鳥嘌呤與胸腺嘧啶不匹配。G：T錯配可以通過DNA錯配修復，甲基化鳥嘌呤也可以被O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶直接去甲基化，從DNA中去除甲基，與其殘基結合。許多膠質瘤細胞系和原代膠質瘤細胞均為O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶缺陷[31]。因此，這些DNA修復系統的功能對于TMZ的療效耐藥性具有重要意義[20]。如果DNA損傷的程度超過了細胞修復的能力，細胞就會被阻滯在細胞周期檢查點，通常是G1/S或G2/M期，并給予完全修復DNA損傷所需的額外時間。如果這種情況下降，該細胞可以激活程序性死亡途徑或停止細胞分裂。不同的情況是可能的，這取決于許多因素，包括未修復的DNA損傷的程度和當前的細胞狀況。因此，TMZ的抗癌作用機制是多種機制的結合。TMZ是治療GBM最有效的藥物，然而，療效往往受腫瘤復發和對TMZ耐藥性的影響。研究表明，抑制誘導TMZ耐藥性產生的保護性自噬能夠治療GBM。例如，自噬抑制因子，如氯喹及其類似物，已應用于治療TMZ的臨床試驗中[32]。但另一研究表明，TMZ也可以通過觸發自噬性死亡提高治療效果。敲低PI3K通路，可以通過進一步上調自噬，阻滯細胞周期發生，提高TG98 GBM細胞系對TMZ的敏感性[33]。Stojcheva等[33]也證明，使用凋亡抑制劑BIM通過靶向敲低微RNA-138，增強膠質瘤細胞的自噬性反應，可以抑制質瘤細胞對TMZ的耐藥。

4 小 結

自噬的雙重作用主要取決于腫瘤的類型及微環境。GBM術后應用TMZ治療能夠激活自噬產生TMZ耐藥，然而當通過調節信號通路使自噬反應進一步加劇時，自噬會誘導GBM細胞發生凋亡，該發現為耐藥性GBM的治療方案的發現打開了新思路。鑒于GBM的高度異質性。針對未來GBM的治療方法可能更多針對GBM的不同分子亞型。在包括GBM在內的各種癌癥中，自噬的關鍵作用發現較晚。自噬在GBM中發揮的作用復雜，進一步研究自噬的多重信號通路以及發現新的信號通路并在其基礎上研究新的治療方案可能成為GBM研究領域的新重點。