特發性腎病綜合征特異性標志物的研究進展

周燕梅，肖厚勤

(1.汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515000； 2.東莞市第五人民醫院腎內科，廣東 東莞 523900)

腎病綜合征是由腎小球濾過膜受損為主要病變而導致大量蛋白質從尿液中丟失的一組臨床綜合征，分為特發性和繼發性兩種[1]。特發性腎病綜合征是臨床診斷的常見類型,其主要病理類型包括膜性腎病、局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)、微小病變腎病(minimal change disease,MCD)、IgA腎病、系膜增生性腎小球腎炎(embranoproliferative glomeru-lonephritis，MPGN)等。常見的并發癥有感染、血栓形成、急性腎衰竭、蛋白質及脂代謝紊亂。目前，腎臟病理形態學診斷是腎病綜合征病理分型的金標準，但仍缺乏分子水平的診斷和分型方法。致病過程中的一些新型生物標志物可用于解釋臨床表現及預后的差異。現就特發性腎病綜合征不同病理類型腎小球疾病的特異性生物標志物的研究進展進行綜述。

1 特發性膜性腎病

特發性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)是成人腎病綜合征的常見病理類型，其特征性的病理學改變為腎小球基膜上皮細胞下免疫復合物沉積伴基膜彌漫性增厚。據統計近年來我國IMN患病率明顯上升[2-3]。由于IMN疾病本身的特性，治療應答率高度可變，因此目前IMN的治療仍存在爭議。因此，對生物標志物進行了廣泛的研究，以確定能從積極的免疫抑制中獲益最大的患者及判斷疾病的預后尤為重要。

1.1血液中生物標志物

1.1.1M型磷脂酶A2受體(phospholipase A2receptor，PLA2R) PLA2R是一組存在于人體各組織器官中的酶系，PLA2R包括M型和N型。人體腎臟組織中表達M型PLA2R。M型PLA2R是Ⅰ型跨膜蛋白，屬于C型外源性凝集超家族甘露醇受體家族，循環抗PLA2R抗體與腎小球足細胞面的PLA2R結合形成原位免疫復合物，激活補體系統，最終形成膜攻擊復合體(C5b-9)損傷足細胞，是IMN的主要致病機制。2009年，Beck等[4]首先發現PLA2R是觸發IMN中抗體應答的靶足細胞抗原，且IMN患者血清中抗PLA2R抗體檢出率為70%，抗PLA2R對IMN的靈敏度和特異度分別為75%和100%。IMN患者血清中抗PLA2R自身抗體主要為IgG4[5-7]，研究認為IMN患者血清中的自身抗體IgG4與PLA2R結合形成原位免疫復合物，激活補體形成膜攻擊復合體C5b-9，進而損傷足細胞，抗PLA2R抗體滴度與IMN的相關性已被證實，且抗PLA2R抗體效價與疾病活動性相關，與24 h尿蛋白呈正相關，并在其他腎小球疾病中尚未檢測到[8-11]。部分研究發現，在接受腎移植患者的血清中抗PLA2R抗體的存在可用于診斷復發性IMN，且在有PLA2R相關性IMN患者中，循環PLA2R的減少優先于臨床緩解，治療結束時PLA2R的持續存在與臨床耐藥性有關[12-14]。因此，血清中檢測出陽性抗PLA2R抗體滴度可作為一種實用性無創性生物標志物用于IMN診斷，并可指導治療及判斷預后。

然而，致病性的實驗證明具有爭議性，很大程度上是由于缺乏令人信服的動物模型，因此最終的因果關系證據仍然缺失。此外，血清抗PLA2R抗體在FSGS或IgA腎病中的研究相對缺乏，且疾病對照的臨床文獻所檢測的病例數相對較少[4,9-11]，需要更多關于測試特異性的數據。另外需要注意的是，一些血清陰性患者具有抗PLA2R抗體陽性的組織免疫沉著物。因此，在設定陰性血清試驗時仍可能需要對PLA2R抗體進行組織免疫染色。此外，在部分繼發性膜性腎病具有抗PLA2R抗體陽性報道[11,15]。因此，可以代表自身免疫和全身性疾病的特異性生物標志物仍需進一步開發。

1.1.21型血小板反應蛋白7A域(thrombospondin type-1 domain-containing 7A，THSD7A) THSD7A是一種分子量為250 000的Ⅰ型跨膜蛋白，具有大的胞外區域，單跨膜結構域和短的胞內尾部[16]。自2009年發現PLA2R以來，70%～80%的IMN可檢測出，剩余20%～30%的IMN可能存在其他內源性抗原參與其發病機制[4]，2014年，Tomas等[17]首先提出THSD7A可能是參與成人IMN的第2個靶抗原，從15份來自PLA2R1抗體陰性的IMN患者血清中識別出分子量為250 000大小的腎小球蛋白，通過質譜鑒定該抗原為THSD7A。同時進行免疫組織化學分析顯示THSD7A定位于足細胞。因此提出血清中抗THSD7A 抗體可作為IMN患者的無創性生物標志物，彌補抗PLA2R抗體的不足。但目前THSD7A在IMN中的具體發病機制尚未明確，且IMN患者THSD7A的陽性率較低，在歐美國家僅為2.5%～5%[17]，中國為2%[15]，日本為9.1%[18]，可能與不同人群的遺傳背景、檢測方法和患者血清采集時間不同有關。此外，抗THSD7A抗體在部分癌癥引發的繼發性膜性腎病患者血清中呈陽性結果，陽性率高達2%[15,19]，因此THSD7A用于臨床診斷IMN的實用性仍需進一步驗證。

1.2尿液中生物標志物 許多研究發現尿液的低分子量蛋白質(包括β2微球蛋白、α1微球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、人類維生素E結合蛋白、IgG、尿補體水平、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶和L-脂肪酸結合蛋白)、白細胞介素-8在預測IMN疾病預后方面具有一定價值[20-23]。然而這些標志物的敏感性和特異性相對較差，且所研究隊列的體積小以及缺乏良好的獨立驗證研究。因此需要使用無偏倚的蛋白質組學方法進行更大規模的研究，以促進IMN中新型尿液標志物的鑒定。

2 FSGS

FSGS是引起腎病綜合征的常見病因，病理光鏡表現局灶分布的階段性硬化的腎小球，階段性毛細血管閉塞、球囊粘連。電鏡超微結構表現為足細胞足突融合、裂孔膜消失和腎小球基膜裸露或皺縮。研究表明,眾多生物因子在FSGS足細胞損傷的發生、發展中發揮重要作用[24-26]。

2.1血液中標志物

2.1.1可溶性尿激酶型纖維酶原激活物受體(soluble urokinase-type plasminogen activator receptor，suPAR) suPAR是失去了糖磷脂酰醇錨的尿激酶型纖維酶原激活物受體異體，主要通過同源結構域Ⅲ與β3整合素的配體結合從而固定于細胞膜上。在體與離體實驗顯示，suPAR過表達時可通過結合足細胞上的β3整合素激活鳥苷三磷酸酶相關C3內毒素底物和細胞分裂周期蛋白42，從而引起腎臟蛋白和腎母細胞瘤基因1等足細胞標志物表達下降，并導致肌動蛋白骨架重構，引起足細胞的損傷、脫落及凋亡，最終導致蛋白尿的產生。同時，suPAR還能被多種物質(如尿激酶、血纖溶酶原等)激活，激活的suPAR能夠催化血纖溶酶原轉化為血纖溶酶，引起遠端小管內血纖溶酶增多，造成患者水鈉潴留出現水腫[24,27]。約2/3的FSGS患者血清suPAR水平升高，患者腎移植后復發的風險增大[24]。但suPAR并不是FSGS的特異性標志物，其他疾病(如腫瘤、感染、炎癥等)也會造成suPAR水平升高[24,27-28]。因此，血清中suPAR 水平能否作為診斷FSGS以及預測FSGS腎移植后復發的依據有待進一步研究。

2.1.2微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一類小的非編碼RNA，其通過翻譯抑制或誘導信使 RNA降解而負向調節基因表達[25]。近年來，miRNA被發現涉及FSGS的發展，如小鼠中miR-193a的轉基因表達誘導足細胞消除和FSGS[29]。另外，miR-193a可以作為主開關來調節人壁細胞上皮細胞向足細胞表型的轉分化[30]。miR-30可通過靶向Notch1和p53來保護足細胞受損[31]。此外，已發現miR-30調節足細胞中的鈣/鈣調磷酸酶信號，從而導致FSGS患者蛋白尿的產生，因此提出血漿miRNA可鑒定為FSGS的一種新的診斷和預后生物標志物[32]。然而，越來越多的證據表明，循環的miRNA可用于各種疾病的研究，如癌癥，心血管疾病，器官移植排斥等[26,33-36]。因此，miRNA用于診斷FSGS疾病的特異性仍需進一步研究。

2.2尿液中標志物 一般來說，FSGS尿液生物標志物研究的樣本量較小，缺乏嚴格的復制。有證據表明CD80的尿液水平可能有助于區分MCD和FSGS[37]，Abatacept(細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4-免疫球蛋白融合蛋白質)是靶向CD80的共刺激抑制劑，Yu等[38]通過使用Abatacept治療5例激素抵抗的FSGS(4例復發性FSGS，1例FSGS)，發現腎臟病理CD80染色陽性，患者取得良好效果，最終蛋白尿可達到部分或完全緩解效果。進而推測CD80可能參與部分FSGS的發病機制。但是尚未證實與治療反應的明確關聯。目前所研究的尿生物標志物都沒有被引入臨床實踐。

3 MCD

MCD臨床表現為腎病綜合征，原發性微小病變腎病的發病高峰在兒童和青少年。腎臟組織在光鏡下可見腎小球結構大致正常，電鏡下僅見足突廣泛消失[39]。目前MCD的發病機制尚不明確，研究認為MCD及FSGS在疾病早期階段有相似病理特征，均為足細胞病變，這給兩者早期診斷及鑒別診斷帶來困難[40]。因此，靈敏的早期診斷標志物及無創性的診斷方法對MCD患者的早診斷、早治療具有重要作用。

3.1血液中標志物 相關研究表明[41]，Toll樣受體-3、Toll樣受體-4和CD80在類固醇敏感性腎病綜合征患者血液中表達水平明顯高于抗類固醇性腎病綜合征患者，此外，這些標志物在MCD患者中表達水平高于FSGS，進而認為Toll樣受體-3、Toll樣受體-4和CD80是用于區類固醇敏感性腎病綜合征和抗類固醇性腎病綜合征患者的有用標志物，且還可用于區分抗類固醇性腎病綜合征患者中活檢證實的MCD與FSGS。然而這些標志物用于診斷MCD的特異性及靈敏度尚不明確，MCD患者尚缺乏設計良好的及多中心血生物標志物對照研究。因此，血液中Toll樣受體-3、Toll樣受體-4和CD80在MCD診斷中的特異性仍存在很大爭議。

3.2尿液中標志物 CD80，又稱B7-1，是共刺激分子B7家族中重要成員之一，是在抗原呈遞細胞表面表達的同源共刺激配體，通過與T細胞上的同源受體CD28和細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4結合而起到共刺激分子的作用，雙向調節傳導在T細胞免疫[42]。近年來，越來越多的證據表明CD80參與尿蛋白的發病機制，尤其是腎小球微小病變[43-44]。Garin等[37]通過收集復發緩解期MCD患者、其他腎小球疾病(FSGS、膜性增生性腎小球腎炎、IgA腎病、膜性腎病)所致的腎病綜合征患者、系統性紅斑狼瘡患者和正常對照者的尿液和血清CD80標本，發現復發性MCD患者的尿液中可溶性CD80水平顯著高于緩解型MCD患者、其他腎小球疾病患者以及系統性紅斑狼瘡患者和健康對照者，從而推測可溶性CD80升高可能與MCD的診斷及發病相關，且尿液CD80排泄可能是區分MCD和FSGS的有用標記[45]。大型單中心臨床對照研究顯示尿液CD80是一種非侵入性的診斷性生物標志物，可用于區別MCD與FSGS，其截斷值為328.98(ng/g肌酐)，靈敏度為81.1%，特異度為94.4%[46]。其后續研究顯示尿液CD80排泄是原發性腎病綜合征患者預后良好的結果，尿液CD80可以用于預測患者的進展及緩解，使用尿液CD80作為預后標記有助于早期識別高危患者，并可能導致更好的治療選擇[46]。然而有研究發現CD80并不是在MCD患者的尿液中特異性升高，在各類原發性腎小球疾病、繼發性腎小球疾病及遺傳性腎小球疾病患者尿液中無顯著差異[47-48]。因此,尿液中CD80能否成為MCD無創性生物標志物仍存在爭議，需大量試驗進一步驗證。

4 IgA腎病

IgA腎病是全球范圍內最常見的原發性腎小球疾病，是慢性腎病和慢性腎衰竭的主要原因，我國報道的IgA腎病發病率為活檢證實的原發性腎小球疾病的45.3%[49-50]。其中約20%的IgA腎病患者在患病10年左右發展成腎功能不全[51]。而5%的患者在短期內出現腎功能惡化進而出現急性腎衰竭[52]。IgA腎病最顯著的組織病理學特點是以IgA為主的免疫復合物沉積于腎小球系膜區，誘發系膜細胞增殖、分泌各種炎癥因子及趨化因子介導腎小球炎癥損傷。然而，目前IgA腎病的確診仍依賴于腎穿刺活檢。近年來隨著對IgA腎病發病分子機制研究的不斷深入，人們發現血清Gd-IgA1(Galactose-defective IgA1)、血清抗IgA O型聚糖抗體、尿液中的某些生物標志物可用于IgA腎病的診斷及預后評估。

4.1血液中標志物

4.1.1血清Gd-IgA1 人類有兩種亞型IgA，即IgA1和IgA2。Suzuki等[53]研究表明，IgA1聚糖鏈區半乳糖化障礙導致O聚糖鏈縮短，頻率增加，IgA1糖基化異常，有助于pIgA1聚集及IgA免疫復合物(IgA-IC)形成，促進IgA在系膜區沉積，IgA-IC活化系膜細胞，導致細胞外基質增生、細胞因子分泌，出現腎損傷。相關研究表明，大多數IgA腎病患者表現出IgA1重鏈的糖基化異常[54-60]。因此，有學者認為血清Gd-IgA1的表達水平可作為IgA腎病的診斷指標。一項大型臨床研究中[61]，研究者通過使用酶聯免疫吸附試驗測定受試者血清中的Gd-IgA1，發現與150名健康白種人成年對照相比，153例高加索成年IgA腎病患者的血清Gd-IgA1水平明顯升高。受試者工作特征曲線下面積為0.90，表明這種標志物可能對該病具有診斷意義。但是在不同族群及年齡段中區分IgA腎病與健康對照的靈敏度有較大的波動，為49%～80%[62]。因此，單獨使用這種標志物的診斷實用性受阻，因為它并沒在IgA腎病患者血清中特異性升高，其水平取決于年齡和族群，隨后的一些研究證實血清Gd-IgA1靈敏度不高[61,63-67]。此外，Gd-IgA1水平在患者及其一級親屬遺傳分析中表明，IgA腎病是在多基因背景下存在主要顯性基因的疾病[68]。因此，血清Gd-IgA1 水平作為IgA腎病的預后評估指標的特異性仍不確定。

4.1.2血清抗IgA O型聚糖抗體 IgA1的鉸鏈區可以攜帶6個相對較短且簡單的糖鏈，稱為O連接的聚糖，每個聚糖通過糖苷鍵連接到絲氨酸或蘇氨酸的氧原子上。這些聚糖以逐步方式合成并包含多達6種不同形式。當O型聚糖僅含有N-乙酰半乳糖胺(Tn抗原)或唾液酸化的N-乙酰半乳糖胺(STn抗原)時，Tn抗原可被IgG和(或)IgA1抗體識別，這些抗體可與半乳糖缺陷型IgA1結合形成循環免疫復合物。這些免疫復合物主要沉積在腎小球系膜區，少量會沉積在足細胞和腎小管上皮細胞，在IgA腎病發病中起重要作用[69]。相關研究利用酶聯免疫吸附測定法檢測血清中針對Gd-IgA1的IgG和IgA自身抗體水平，發現與健康志愿者及其他類型腎小球疾病相比，上述自身抗體水平在IgA腎病患者血清中顯著升高[66,70]。此外，Suzuki等[69]首先開發了免疫印跡法測定聚糖特異性IgG抗體，發現該抗體的血清水平在IgA腎病患者中顯著升高，受試者工作特征曲線分析表明，當針對半乳糖缺陷型IgA1的血清IgG抗體水平的特異度達到0.95時，相應的靈敏度為0.88。研究還發現IgG自身抗體與Gd-IgA1結合的強度與蛋白尿/肌酐比例相關[69]，此外，IgG自身抗體水平升高的患者，在15年的隨訪期內可能需要行透析治療或出現死亡[66]。上述研究表明，這種自身抗體可能有助于監測疾病進程和(或)疾病的治療反應，從而提出這些聚糖特異性抗體與IgA腎病的發展具有相關性，可能成為代表疾病特異性標志物和潛在的治療靶標。

4.2尿液中標志物

4.2.1尿液miRNA miRNA是非編碼RNA，分子很短(大約22個堿基)，可通過與靶mRNAs的3′非翻譯區不完全堿基配對進行后調節基因表達[71-72]。它們調節基因組大部分的表達且有助于調節多種細胞功能，包括細胞增殖、凋亡和分化。近年來，有學者提出miRNA參與IgA腎病的發病機制，認為miR-148b的過度表達可抑制糖蛋白-N-乙酰半乳糖胺3β-半乳糖基轉移酶1，導致產生半乳糖缺陷型IgA1，其沉積在系膜并誘導增殖和內吞運輸(由miR-17-5p)，從而引起腎內炎癥反應的發生，而miR-29c是一種抗纖維化的miRNA，可能在疾病進展的晚期階段起重要作用[73]。有研究發現[74-75]，IgA腎病患者尿液中miR-146a、miR-155、miR-93水平顯著高于健康對照組。而尿液中miR-29b和miR-29c的水平較健康對照組顯著降低，且IgA腎病蛋白尿的嚴重程度與miR-146a和miR-155呈正相關。蛋白尿水平與尿液miR-29c水平呈負相關，腎功能與尿液中miR-21和miR-29c水平相關。另一項研究顯示，IgA腎病患者尿液中miR-3613-3p的表達下調，且miR-3613-3p和miR-4668-5p的尿液水平與疾病嚴重程度相關[76]。因此miRNA可能被用作診斷和監測IgA腎臟疾病的生物標志物，然而，目前miRNA亞型較多，且miRNA在IgA腎病發病機制中的作用仍不明確，仍需更多的研究證實miRNA與IgA腎病的關聯。

4.2.2其他尿液生物標志物 相關研究發現，表皮生長因子、單核細胞趨化肽-1、尿可溶性轉鐵蛋白受體、腎損傷分子-1、白細胞介素-6在IgA腎病腎病患者尿液中高表達，且尿液中的表皮生長因子水平與IgA腎病中腎小管間質損傷的程度呈負相關,表皮生長因子/單核細胞趨化肽-1比值與IgA腎病的進展呈負相關[77-78]。Asao等[79]研究表明尿液中足細胞標志蛋白(podocalyxin)水平和足細胞數量與IgA腎病的腎小球損傷程度相關。此外，與無節段性硬化的患者相比，節段性腎小球硬化患者的足細胞數量顯著增加。

5 MPGN

MPGN是一個病例形態學診斷，以彌漫性腎小球系膜細胞增生及不同程度系膜基質增多為主要病例特征[80]。主要臨床表現為腎病綜合征，可伴血尿、高血壓及腎功能損害，常伴有持續性低補體血癥[80]。MPGN好發于8～16歲的兒童和青少年，且在我國的發病率較高，若得不到及時的干預治療，大部分患者最終發展為終末期腎病，預后較差[81]。然而目前本病致病機制、原因尚未完全闡明，現公認MPGN是免疫介導的炎癥性疾病。大部分研究表明，血清補體檢測在MPGN中具有重要意義[80,82-85]。

免疫復合物介導性MPGN患者，免疫復合物激活補體經典途徑，產生的趨化因子C3a、C5a介導血小板、白細胞的聚集，膜攻擊復合物直接導致細胞損傷[86]。補體介導性MPGN可能與失控的補體旁路途徑激活有關。在很多致密物沉積病患者血清中可以檢測出C3腎炎因子，是一種針對自身C3轉化酶的IgG抗體，增加了C3轉化酶的穩定性與活性，從而增加C3的裂解。高達40%的C3腎小球疾病患者血清中可檢測到C3腎炎因子[86]。然而C3腎炎因子在健康個體的一小部分及其他類型腎臟疾病中也可檢測到[87-88]，因此，C3腎炎因子在MPGN中的診斷特異性仍不清楚。MPGN患者尚缺乏設計良好的尿液生物標志物研究。

6 小 結

近年來在腎小球疾病的機制和特定分子途徑方面取得了顯著進展，這些發展已經加速了生物標志物的發現，并為潛在的治療干預提供了新的候選途徑。如生物標志物 CD80、 PLA2R、THSD7A等對腎病綜合征的病理分型具有指導作用，但目前仍未發現替代腎臟穿刺活檢的非創傷性的診斷及預后評估的方法。我國關于腎小球疾病發病機制及預后判斷的相關研究資料較少，高質量、大樣本的臨床研究有助于發現及驗證可靠的腎小球疾病相關生物標志物，新型標志物的不斷出現將為精準診斷和治療開辟新的路徑，同時對提高療效、減少藥物毒副反應及改善預后等方面具有重要的臨床意義。