生殖支原體耐藥及機制研究進展

程燦燦，古裕蓮

(廣州市番禺區中心醫院檢驗科，廣州 511400)

生殖支原體是目前發現能獨立復制的最小的原核細胞生物。在其發現的最初十幾年內都少有關注，這與其生長緩慢，培養要求嚴格不無關系。然而隨著技術的進步，尤其是聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術的應用，生殖支原體在性傳播疾病中的致病作用逐漸得到重視。由于分子診斷學在臨床及科研中的廣泛應用，生殖支原體被證實是男性非淋球菌性尿道炎(non-gonococcal urethritis，NGU)的獨立致病菌之一[1]，也被認為可引起女性的宮頸炎、子宮內膜炎及盆腔炎等疾病[2]，嚴重影響人們的泌尿生殖健康。生殖支原體主要通過生殖道黏膜接觸傳播，也有研究發現生殖道-肛門接觸同樣可以進行傳播[1]。國外的研究發現，生殖支原體的感染或攜帶多發生在25歲以后[3]。各國學者對生殖支原體在NGU男性中的患病率進行了很多調查，發現在NGU患者中生殖支原體感染率較高，在復發性、沙眼衣原體陰性的NGU患者中生殖支原體感染率甚至更高。目前，核酸檢測是診斷這種病原體感染的最主要手段。生殖支原體具有支原體類的無細胞壁的共性，在治療上對抑制細胞壁生長的抗生素無效，只能選擇干擾蛋白質合成或干擾DNA復制的抗生素。臨床上用于治療生殖支原體感染的有大環內酯類(代表藥物阿奇霉素)、喹諾酮類(代表藥物莫西沙星)、四環素類(代表藥物多西環素)和鏈陽性菌素類(代表藥物普那霉素)抗生素。不同于其他支原體的是，生殖支原體體外純培養比其他支原體難度大，體外藥物敏感性試驗更是耗時長且缺乏標準。針對這類感染，臨床上通常進行經驗性用藥治療。這也可能是生殖支原體感染的治療效果不好且耐藥現象漸增的一大原因。現對生殖支原體的耐藥性監測、目前的耐藥現狀及機制進行綜述。

1 生殖支原體耐藥性監測

由于生殖支原體對營養要求苛刻，生長極其緩慢，從臨床標本中分離出的生殖支原體很難在無細胞培養基上生長。研究表明，應用尿道拭子標本，單純的SP4培養基初代分離培養時間為1～3個月，Vero細胞培養法大約為3周[4-5]。這也給生殖支原體的體外藥物敏感性檢測帶來困難，至今尚未有公認的標準方法來評價臨床標本中生殖支原體的藥物敏感性，現有的報道多數都是參考其他已有標準的支原體進行研究。目前體外藥物敏感性檢測方法主要有3種：瓊脂稀釋法、肉湯稀釋法和細胞培養法。

1.1瓊脂稀釋法 早在1989年，Hannan[6]就已經研究了生殖支原體在內的多種支原體瓊脂稀釋法藥物敏感性檢測，并在關于支原體屬(獸醫)最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)值檢測的推薦和指南上做了改進和詳細介紹。與傳統的平板稀釋法相似，菌液被接種在含有一系列抗生素(濃度差為2倍)的瓊脂平板上，通過觀察平板菌落生長情況判定MIC值。但此研究確定的MIC是能抑制性50%菌落的最低抗生素濃度，而現在普遍認為，MIC是能抑制菌落生長的最低抗生素濃度。也有報道用E-Test方法在瓊脂上檢測較準確的MIC值，但限于成本高昂且生殖支原體在體外生長耗時長(>7 d)[7]，未能在臨床推廣。Bébéar等[8]應用瓊脂稀釋法檢測了生殖支原體對莫西沙星的體外抗菌活性。近年很少有報道用瓊脂稀釋法來檢測生殖支原體的體外藥物敏感性。

1.2肉湯稀釋法 目前，肉湯稀釋法主要應用SP4液體培養基。將抗生素按2倍梯度稀釋加入SP4培養基中，接種一定量的生殖支原體(通常104～106CFU/mL)，置于96微孔板中封板37 ℃孵育3～28 d，MIC值為抑制顏色改變的抗生素最低濃度。盡管這種藥物敏感性試驗方法簡單易行、成本也相對不高，但生殖支原體在這種無生命的液體培養基中生長過于緩慢，很難用于臨床常規檢測。多數研究根據美國臨床實驗室標準化協會推薦的人型支原體MIC法進行生殖支原體的體外藥物敏感性檢測[9]。楊安波等[10]報道，應用商品化的生殖支原體藥物敏感性試劑盒，評價了61例臨床分離生殖支原體菌株對12種抗生素的敏感性。有研究應用一種無線磁電傳感器裝置，通過檢測SP4培養基中生殖支原體生長時共振頻率的變化，實時監測生殖支原體的生長，并應用該方法評價了四環素和左氧氟沙星的體外抗菌效果[11]。這種實時監測技術在研究充分的條件下，也許能彌補肉湯稀釋法藥物敏感性培養周期長這一缺陷。

瓊脂稀釋法是最早用于檢測生殖支原體體外藥物敏感性試驗的方法，其次是應用SP4培養基的肉湯稀釋法。盡管這種藥物敏感性方法簡單易行，成本也相對不高，但生殖支原體在這種無生命的液體培養基中生長過于緩慢，很難用于臨床常規檢測及科學研究，近年鮮有相關報道。

1.3細胞培養法 1996年Jensen等[12]首次用Vero細胞與患者標本共培養，進行生殖支原體分離培養并用PCR方法監測其生長情況。此后，細胞培養法便被大量應用到生殖支原體的初代分離及后續的體外藥物敏感性試驗中。將Vero細胞培養與TaqMan PCR技術同時應用于生殖支原體的藥物敏感性監測已成為較成熟的技術[13-14]。TaqMan PCR是根據生殖支原體的生殖支原體Pa基因保守區設計的定量方法，將定量的DNA載量運用到抗生素對生殖支原體的抑菌率計算中，根據抑制率達到99%時的最低抗生素濃度確定MIC值。Mondeja等[15]對上述的培養方法做了改進，培養成本適當降低。Hamasuna等[16]將肉湯稀釋法與細胞培養法進行比較，發現兩者測得的MIC值結果相近。相對于肉湯稀釋法，該法明顯縮短了培養時間，在科研工作中被廣泛應用。但成本相對提高且對技術要求相對更高，目前也僅限于研究。

耐藥性檢測除了上述的體外藥物敏感性試驗外，臨床治療效果觀察也被視為一個手段。另外，針對生殖支原體的耐藥位點進行DNA水平的耐藥性檢測已經逐漸被臨床應用，與DNA鑒定同時檢測即可完成生殖支原體的鑒定與藥物敏感性預測，極大解決了生殖支原體培養及體外藥物敏感性試驗生長困難、耗時長的問題。核酸技術的迅速發展為生殖支原體這種人工培養較難的支原體的研究提供了更多的手段，在前述的眾多研究基礎上，開展生殖支原體的檢測及耐藥性監測正在臨床診治和科學研究中逐漸變得可行。

2 生殖支原體對四環素類的耐藥現狀及耐藥機制

四環素類藥物的抗菌作用方式是通過與細菌核糖體30S亞基的A位點結合抑制氨酰基tRNA與核糖體的作用，從而阻斷肽鏈的延長及蛋白的合成。四環素、米諾環素和多西環素作為代表藥物，在治療支原體感染時，尤其是解脲支原體，敏感性較好。多西環素作為治療NGU的一線藥物，在一部分地區被用來經驗性治療生殖支原體所致的泌尿系感染。但從大量的臨床治療發現，多西環素在治療生殖支原體感染時的治愈率低，常延誤正確的治療而發生持續感染，并且治愈率還在不斷下降[17]。

由于生殖支原體沒有針對體外藥物敏感性的標準，參考肺炎支原體的體外藥物敏感性折點MIC≤2 mg/L計算，則生殖支原體對于多西環素在體外藥物敏感性試驗非常敏感，但這與臨床治療效果不符。有學者提出應將生殖支原體的藥物敏感性折點降低至MIC≤0.25 mg/L[18]，應用新折點再解釋生殖支原體感染治療失敗就發現，治療失敗率與生殖支原體對多西環素的體外不敏感率幾近吻合，但這一現象尚需進一步研究探討。目前，在報道中僅有發現生殖支原體對四環素及多西環素在體外的敏感性出現降低及臨床上的治療失敗的現象，并未發現其相關的耐藥基因突變。在人型支原體和解脲支原體中檢出的與四環素類耐藥相關的tetM基因突變，并未在生殖支原體菌株中檢出，且尚未發現新的與其相關的耐藥機制。鑒于多西環素治療生殖支原體感染效果不佳，該藥不被推薦作為生殖支原體感染的治療，或者僅在一、二線治療生殖支原體感染的藥物均無效的情況下使用。

3 生殖支原體對大環內酯類的耐藥現狀及耐藥機制

細菌的核糖體50S大亞基是大環內酯類抗生素的作用靶位，主要由23S rRNA和核糖體蛋白(L22核糖體蛋白和L4核糖體蛋白)構成。細菌對大環內酯類藥物有多種耐藥機制，從對肺炎支原體和解脲支原體的大量研究中發現，支原體對大環內酯類的耐藥機制主要是23S rRNA基因和核糖體蛋白基因L4、L22的基因突變，導致藥物作用靶位改變[19]。國內關于生殖支原體對于該類藥物耐藥機制的研究不多。但國外的診療指南指出阿奇霉素是臨床上治療生殖支原體感染所致NGU的一線藥物。近年報道發現，生殖支原體對其的耐藥性已相當嚴重了，且耐藥率還在不斷上升[20]。

從臨床標本中分離或檢測到的大量阿奇霉素耐藥菌株，攜帶23S rRNA基因2058和或2059位點突變[21-22]，這兩個位點位于該基因Ⅴ區。其單核苷酸突變類型，在生殖支原體中的檢出率由高到低依次為 A2058G，A2059G，A2058T，A2058C，A2059C和A2059T[18]。除了上述兩個位點，23S rRNA其他位點突變也可能導致耐藥，但少有報道。目前，23S rRNA基因的2058和2059堿基位點突變被普遍認為與生殖支原體抵抗阿奇霉素的機制有關，最新的治療及診斷指南都將該位點的檢測推薦應用于NGU患者的診治[23-24]。有些地區早在2008年就開始對臨床標本常規檢測生殖支原體的大環內酯類耐藥基因[14]。在北歐部分國家的調查研究顯示，23S rRNA的突變率在生殖支原體感染的患者標本中達41%[25]，而加拿大有47.3%[26]，新西蘭有72%[27]。如此高的突變率，研究者認為可能是該地區常規用阿奇霉素單劑1 g治療生殖支原體感染患者，造成耐藥菌株的篩選，其他的研究也支持此觀點[28-29]。

新藥交沙霉素和普那霉素被用來治療多重耐藥的生殖支原體感染，但僅在有限的地區使用[2,23]，近年來研究顯示，這些藥物也出現了臨床治療失敗的案例。Guschin等[30]在1例久治不愈的生殖支原體感染患者中發現了23S rRNA基因的2062位堿基由A突變成了T的生殖支原體菌株，這一突變位點在肺炎支原體和人型支原體中報道與交沙霉素高水平耐藥有關，與帶有十六碳內酯環的藥物耐藥性相關，而并不影響十五碳內酯環的藥物的敏感性。因阿奇霉素與交沙霉素內酯環結構上的差異，理論上A2062T位點不參與抵抗阿奇霉素的機制。

L22與L4核糖體蛋白形成的環形結構與大環內酯類藥物結合空間位置有關，其內酯環結構對應的氨基酸位點是L22為Arg88-Ala93，L4為Gln62-Gly66(參考大腸埃希菌相應蛋白中的氨基酸位置)[31]。該區域的氨基酸改變可能導致核糖體的空間構象改變，進而導致大環內酯類藥物不能與靶位結合而失去抗菌作用。Jensen等[14]發現4株L22基因突變導致的單個氨基酸發生替換，但位點均不在上述位置。其他關于L4突變的研究未發現明確的證據證明與大環內酯類耐藥性相關[19]。但在肺炎支原體耐藥性研究中發現，核糖體蛋白L4和L22突變僅可能導致其低水平耐藥，常與23S rRNA基因Ⅴ區突變同時存在。

4 生殖支原體對喹諾酮類的耐藥現狀及耐藥機制

喹諾酮類藥物中的莫西沙星是治療生殖支原體感染的二線藥物，通常用于對阿奇霉素治療失敗病例。隨著莫西沙星在治療中的應用，耐喹諾酮類的生殖支原體菌株不斷增多，在許多地區已經出現了與大環內酯類相同的耐藥趨勢[32]。在亞太地區和英國都有莫西沙星治療生殖支原體感染失敗的案例，前者的發生率更高[33-34]。西他沙星被認為與莫西沙星有著相同的抗菌效果，在日本等地有較多的臨床應用。而氧氟沙星和左氧氟沙星的體外及體內抗生殖支原體效果均較弱，未被推薦作為臨床治療生殖支原體感染用藥[35]。

生殖支原體對喹諾酮類藥物耐藥的機制與喹諾酮耐藥決定區(the quinolone resistance-determining region，QRDR)突變有關。QRDR包括旋轉酶gyrA、gyrB基因和拓撲異構酶ⅣparC、parE基因的某些區域。喹諾酮類藥物通過與酶蛋白-DNA復合體結合，阻止DNA復制，進而達到抗菌目的。研究發現，臨床菌株中parC的單核苷酸突變所致拓撲異構酶Ⅳ氨基酸改變與生殖支原體對莫西沙星和西他沙星耐藥高度相關且發生率漸增(37%～47%)，其常見氨基酸突變位點及突變模式為S83I、S83N、D87N、D87Y和D87H[34,36-39]，其中以S83I和S83N最為重要。其次報道較多的是gyrA基因突變，所致的旋轉酶氨基酸位點及突變模式為D87N[40]。總的來說，parC或gyrA發生單核苷酸突變時可造成生殖支原體對喹諾酮類藥物敏感性明顯降低，而同時攜帶上述兩種基因的單核苷酸突變時，生殖支原體通常會對喹諾酮類藥物顯示出高水平耐藥。研究還發現，不同的突變模式可能涉及不同藥物的敏感性，如parC的突變模式S83I對莫西沙星的MIC值有明顯影響，而對西他沙星的MIC值影響稍小[34,40]。QRDR的另外兩個區域parE和gyrB，其突變位點并未被大量研究，主要原因可能是其突變發生率較低。僅有的少量研究顯示，當其與parC上述突變聯合存在時，常導致對喹諾酮類的高水平耐藥[32]。臨床隨訪研究顯示，QRDR突變的出現可能并不是由于治療生殖支原體時藥物篩選的結果[41]，不同突變位點的出現及對其他喹諾酮藥物的影響仍在研究中。

5 小 結

目前，生殖支原體被認為是僅次于沙眼衣原體的NGU致病菌，在體外的常規培養及藥物敏感性監測均較困難，臨床上又快速出現了對一線、二線抗生素的抵抗，使得治療難度加大。國內外對生殖支原體耐藥及機制研究已從之前體外藥物敏感性方向轉向對其DNA水平方向，并主要集中對大環內酯類和喹諾酮類耐藥機制的上。研究其耐藥機制及開發新的更有效的抗生素是目前生殖支原體研究中亟待解決的問題。鑒于目前的研究結果，建議對于初診NGU患者，應使用PCR檢測是否為生殖支原體感染，并對大環內酯類耐藥相關的23S rRNA基因位點及喹諾酮類耐藥相關的parC，gyrA基因位點進行檢測，根據檢驗結果和治療指南再調整合理的治療方案，避免經驗性用藥治療，以防生殖支原體治療失敗或持續感染，甚至造成對耐藥菌株的篩選。