草酸鈣晶體在乳腺內形成機制的研究進展

俞柯杰，蔡振剛

(大連醫科大學附屬第一醫院乳腺外科，遼寧 大連116023)

乳腺癌是目前威脅女性健康的主要疾病之一，雖然乳腺癌的發病率呈上升趨勢，但死亡率呈現下降趨勢，這得益于乳腺癌的早期發現和綜合性治療。乳腺鉬靶是篩查早期乳腺癌的主要方法，其中30%～50%的非觸及型乳腺癌是通過乳腺鉬靶中出現微鈣化而發現的。Frappart等[1]提出礦化物的分類，乳腺內的微鈣化從化學組成成分上主要分為兩種類型：Ⅰ型以草酸鈣為主，Ⅱ型以羥基磷酸鈣為主。Ⅰ型見于良性乳腺病變及部分小葉原位癌；Ⅱ型見于乳腺癌及部分良性疾病，良性疾病的礦化物中可含有少量的蛋白類物質及碳酸鈣[2]，并且礦化物中碳酸鈣含量越多，乳腺病灶的惡性程度越低[3]。近年來研究發現，在乳腺癌礦化物中可以檢測到羥基磷酸鎂，但在良性病變中未觀察到[4]。在乳腺癌的礦化灶中銅元素較良性病變高，而錳元素降低。在結晶程度和形態上，草酸鈣結晶程度好，可以形成多面體狀晶體，而羥基磷酸鈣則結晶度較差，形成晶體細小，甚至呈無定形態[5]。雖然良惡性乳腺病變的微鈣化在組成成分上不同，但在臨床工作中主要是通過乳腺鉬靶進行觀察，這類病例在乳腺影像報告和數據系統分級上多屬于4類，如何進一步鑒別良惡性是困擾臨床醫師的難題。現就草酸鈣的特點及相關形成機制進行綜述，為進一步探討乳腺中的草酸鈣礦化形成提供相關線索，為深入研究鑒別乳腺疾病良惡性微鈣化提供新思路。

1 乳腺內草酸鈣的病理特點

在研究乳腺中草酸鈣的形成機制前首先要了解草酸鈣形成時的病理特點，如草酸鈣在乳腺內的形態、分布位置、周圍組織的病理改變等，這對形成機制的研究具有重要意義。草酸鈣在常規染色切片中缺乏親和力，著色不顯著，很容易被忽視，而在偏振光顯微鏡下草酸鈣晶體具有雙折光性[6]。目前研究認為草酸鈣主要見于良性疾病，乳腺內能形成礦化物的良性疾病主要有乳腺纖維腺瘤、乳腺內脂肪壞死和乳腺增生癥，其中乳腺增生癥的鈣化與乳腺癌內鈣化在影像學上最容易混淆[7]。①乳腺增生癥的礦化病理表現為礦化物位于管腔內，呈砂粒體樣或鮞狀，直徑5～100 μm。礦化顆粒較小時位于腺上皮細胞與基膜之間。礦化顆粒體積較大時，其發生在腺腔或腺上皮與上皮基膜之間，顆粒中央染色常呈均質淺染狀，腺上皮細胞常可見頂端的胞質突起。增生癥的礦化物中存在Ⅳ型膠原，未檢出Ⅲ型膠原。②乳腺纖維腺瘤的礦化常見病理表現為大片狀無定型礦化，常伴有陳舊性壞死改變，在壞死的周邊也可觀察到沿間質膠原分布的泥沙樣礦化，其礦化物中基本存在Ⅲ型膠原，而Ⅳ型膠原僅在腺腔內砂粒體樣礦化周圍可見。③乳腺脂肪壞死的礦化病理表現為粗細不一的無定形的泥沙樣狀，直徑1～50 μm，缺乏明顯的同心圓狀結構。免疫組織化學法可以檢出Ⅲ型膠原，但未見Ⅳ型膠原[8]。

2 乳腺中草酸鈣的形成機制

草酸鈣由草酸根離子與鈣離子結合形成，是各類結石以及鈣化的主要成分。草酸鈣在腎結石中的研究較為深入，但乳腺中草酸鈣的形成機制目前尚不明確，相關研究較少。

2.1草酸鹽的來源 外源性草酸的來源是經腸道吸收富含草酸的食物，如菠菜、大黃、莧菜、甜菜、花生、馬齒莧、芋頭、甘薯、巧克力等[9]。乳腺中的草酸成分主要為內源性草酸，內源性草酸前體物質為乙醛酸、抗壞血酸、羥脯氨酸、甘氨酸等。其中乙醛酸是草酸的主要前體，其通過酶解形成草酸，主要的酶有乙醛酸氧化酶、黃嘌呤氧化酶和乳酸脫氫酶，其中以乳酸脫氫酶的作用為主。抗壞血酸來源的草酸鹽占30%～50%，攝入抗壞血酸可提高內源性草酸水平，是結石的危險因素之一[10]。抗壞血酸先轉化為L-抗壞血酸，最終分解成草酸和蘇糖酸，這是一個自發緩慢的降解過程。目前認為氧化應激可促進組織內草酸鹽的生成及代謝，從而造成草酸在組織內的沉積[11]。除此之外，正常人體的胃腸道細胞更新較快，大量細胞內RNA分解出尿嘧啶被吸收，經過與多聚磷酸結合，環裂解形成草酸、氨基甲酸及尿素等[12]。草酸鹽是一種有機二元羧基陰離子，體內存在形式包括溶解形式的草酸鈉、草酸鉀或不溶解的草酸鈣。草酸鹽是體內代謝活動的最終產物，人體不能繼續分解草酸鹽。草酸鹽在細胞內聚集具有細胞毒性作用，草酸鈣的形成是人體排除有害物質的表現。

2.2草酸鈣的合成部位 目前對草酸鈣晶體的形成機制尚不清楚，但它們的合成必然與草酸根離子和鈣離子在體內特定區域大量積累有關。細胞內質網是鈣離子的主要儲存場所，在維持鈣離子穩態方面發揮重要作用，從而推測合成草酸鈣的位置在內質網。有研究表明，內質網的不穩定導致鈣離子的內穩態失衡，造成鈣離子在內質網中逐漸累積，進一步促進疾病的形成，而草酸鹽可增加內源性內質網應激標志物葡萄糖調節蛋白及C/EBP同源蛋白的表達，在誘導內質網應激方面起關鍵作用[13]。腫瘤細胞中的葡萄糖調節蛋白增加可激活促腫瘤信號，加快腫瘤進展[14]，故內質網因細胞內鈣離子穩態失衡可引起內質網氧化應激，進一步促進細胞凋亡[15]，而內質網應激在腫瘤的發生、發展、轉移中均發揮重要作用，包括乳腺癌[16]。結上所述，草酸鹽誘導內質網應激，促使內質網中鈣離子聚集，進一步形成草酸鈣結晶，故可初步推測草酸鈣的合成部位與細胞內質網相關，且與腫瘤的形成有一定關聯。

2.3鈣離子轉運 鈣離子作為細胞信號轉導通路中重要的第二信使，可參與并調節細胞遷移，有證據表明提高鈣離子的濃度可促進腫瘤細胞的轉移[17]。乳腺中的鈣離子轉運是整體單向轉運，鈣離子跨膜轉運的過程必須具備大容量、單向和誘導特性的通道，而鈣離子通道可發揮這一作用，其中一類通道為瞬時受體電位陽離子通道，在維持乳腺鈣離子穩態上及轉運中起重要作用。然而鈣離子作為細胞內的信使并不能直接發揮作用，需要鈣離子緩沖區及鈣離子調節蛋白來翻譯其信號。在內質網腔中存在鈣網蛋白，其是主要的鈣離子結合蛋白，可增加鈣離子的累積能力，并有分子伴侶作用，可確保蛋白質正確合成、折疊[18]。內質網可吸收大量細胞質的鈣離子，且鈣網蛋白加強了內質網腔對鈣離子的緩沖能力，胞內鈣離子濃度的增加為草酸鈣晶體的形成提供了充足的鈣源，而鈣濃度的變化對草酸鈣晶體的形態及水化狀態均具有影響[19]。在伴有微鈣化的乳腺細胞中，許多鈣離子通道增加，如瞬時受體電位陽離子通道和相關蛋白附件A2、A4和A5的數量較非腫瘤細胞明顯增多。這些蛋白通道及附件可以增加細胞內鈣離子的濃度。同時也有證據顯示，瞬時受體電位陽離子通道7在伴有微鈣化的乳腺細胞中表達增加，可促進細胞增殖、遷移和轉移[20]。目前鈣離子通道也是乳腺癌潛在的藥物靶點。

2.4草酸根轉運 植物細胞內草酸根的前體是抗壞血酸,將抗壞血酸轉化成草酸是在細胞的質體上進行加工轉化[21-22]。形成的草酸在液泡中與鈣離子相結合，通過液泡中的小室及基質調控晶體的成核及生長[23]。動物體內草酸的前體物質主要為乙酸醛、抗壞血酸、羥脯氨酸、甘氨酸等，這些物質都要經過復雜的代謝途徑產生煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和副產品草酸，草酸根的合成部位與線粒體關系密切。草酸進入細胞是通過跨膜轉運，主要通過SLC26家族的轉運蛋白進行[24]。SCL26是陰離子轉運蛋白，SLC26基因家族可以在各種組織中表達，編碼多種陰離子交換劑和陰離子通道。目前發現SCL26有11個成員，但SLC26A10可能是一個假基因。與草酸轉運有關的成員包括SLC26A1、SLC26A2、SLC26A3、SLC26A6、SLC26A7和SLC26A9，轉運方式包括草酸根離子/氯離子交換、氯離子/碳酸氫根離子交換、硫酸根離子/草酸根離子交換[25-26]。

2.5草酸鈣的囊泡轉運 草酸鈣在乳腺上皮細胞內合成后以主動分泌的形式釋放到細胞外基質。乳腺內的分泌細胞起源于末端導管-小葉單位。在病理切片中可觀察到分泌腺化生細胞存在頂端分泌突起，并在細胞內也觀察到囊泡[27]。囊泡轉運是細胞中物質和信息交流的主要方式，囊泡的分泌過程包括出芽、轉運、靶向、拴系、錨定、啟動、融合和胞吐。囊泡出芽是由包被蛋白介導的，包被蛋白是一種動態結構，由小GTP蛋白家族中的Arf1/Sar1蛋白從胞質募集結合到膜上又從膜上脫落。轉運是從產生點向分泌區的移動，一般是在馬達蛋白的牽引下沿細胞骨架(微絲/微管)向分泌活動區運輸。靶向是在 exocyst-sec6/8復合體介導下與細胞骨架相互作用。拴系是在小GTP蛋白家族中的Rab蛋白與可溶性因子Vsolp/p115共同作用下促進囊泡與胞膜的可逆性黏合。錨定通過可溶性的N-乙基馬來酰亞胺敏感因子連接物復合體在囊泡膜和細胞膜間形成穩定的三分子結構。其一是小突觸泡蛋白和突觸融合蛋白組成，另兩個是由突觸小體相關蛋白SNAP-25組成。復合體形成“亮氨酸拉鏈樣”的嵌入式結構，并延伸進入胞膜脂質雙層，參與囊泡膜融合體的形成。囊泡轉運中的膜融合過程都是由可溶性的N-乙基馬來酰亞胺敏感因子連接物復合體介導，融合指脂雙層的融合，包括兩步：首先脂雙層克服脂質分子頭部間水合力的作用被拉近，然后脂雙層的親水部分和疏水部分間邊界的去穩定，最終融合孔打開和快速擴展[28-30]。囊泡內的草酸鈣排出細胞進入管腔或細胞基質間隙。

2.6草酸鈣的礦化 乳腺內草酸鈣晶體在細胞外聚集增大的機制目前較少見報道。作為草酸鈣晶體最常見的部位是腎結石，其次是各種腫瘤內的鈣化灶，如甲狀腺乳頭狀癌、胃癌、腦膜瘤、卵巢漿液性乳頭狀癌等[31]。現階段研究最為深入的是腎結石的形成，了解腎結石中草酸鈣的相關形成機制可以為乳腺內草酸鈣鈣化灶的形成提供思路。腎結石形成理論主要包括以下幾種。①上皮細胞損傷：在草酸鹽的誘導下細胞膜的酸性磷脂酰絲氨酸通過外翻和側向運動可在特定區域聚集，吸引鈣離子與草酸根離子相互作用，導致草酸鈣晶體成核。此外，損傷的細胞表面表達α3整合素、白細胞分化抗原分化群44、透明質酸等，這些因子均與草酸鈣有極強的親和能力，促進草酸鈣晶體生長。②Randall斑學說在上皮損傷發生時骨橋蛋白表達增強，后者能夠募集周圍巨噬細胞吞噬羥基磷灰石晶體，轉運到細胞基膜，以羥基磷灰石為成核點，草酸鈣聚集結晶。目前研究認為最先形成的羥基磷灰石晶體與鈣化性納米微粒有關，在乳腺鈣化灶的研究中也發現鈣化納米微粒的存在[32]。③晶體抑制物缺乏學說:體內骨橋蛋白、基質Gla蛋白、胎球蛋白A是重要的抑制鈣化因子，其缺乏時草酸鈣容易成核[32-33]。另外，雖然草酸鈣形成的礦化灶多存在于乳腺良性病變，但部分乳腺小葉癌鈣化中也存在草酸鈣。了解乳腺癌中微鈣化的礦化機制，亦可對草酸鈣礦化灶的形成提供線索。目前認為[3-4]乳腺癌細胞經過上皮-間充質化并且獲得成骨細胞特征，在骨形態發生蛋白的參與下轉化為成骨樣細胞，并且表達微鈣化相關蛋白。隨后載有微鈣化相關蛋白的脂筏從細胞膜脫落，形成基質囊泡并進入細胞。該基質囊泡的pH值不同于細胞質的pH值。因此，在適當的pH下單晶體形成，然后基質囊泡被釋放到細胞外基質中。在細胞外基質中單晶體起著核的作用，細胞外液含有的鈣離子繼續以此為成核點聚合，晶體逐步生長增大，從而形成礦化灶。此外，在炎癥因子CC趨化因子配體2、CC趨化因子配體5和集落刺激因子1的作用下，募集大量腫瘤相關巨噬細胞到微鈣化周圍，這些巨噬細胞通過分泌基質囊泡到晶體的成核位點，從而進一步傳播這一過程[34-35]。目前一些研究結果支持草酸鈣的形成可能與細胞主動分泌的產物相關，而磷酸鈣的形成可能是與骨生理礦化過程類似的主動過程，而不是與細胞退化相關的被動的終末期過程[27，36]。此外，研究還發現部分上皮細胞具有間充質特性，能產生乳腺草酸鈣微鈣化[3-4，36]。在乳腺中，頂漿分泌細胞起源于末梢導管小葉單位，頂漿分泌口通常存在于頂漿上皮化生細胞，胞質內可見液泡。管腔內草酸鈣晶體偶見與頂漿上皮化生有關，尤其是在擴張的導管中[37-38]。

3 草酸鈣與乳腺癌的關系

以往一般認為乳腺中的草酸鈣鈣化灶只存在于乳腺良性病變，如乳腺囊腫、積乳及增生病變[37]。在惡性病變中草酸鈣僅限于預后良好的小葉原位癌，因此乳腺疾病中草酸鈣礦化的研究未得到重視。但有研究表明，草酸鈣晶體既與浸潤性癌有關，也與原位癌有關[39]。有病理學研究發現[27]，乳腺癌組織中草酸含量高于非癌性乳腺組織；免疫組織化學結果顯示，在乳腺切片中，癌組織表達的c-Fos 基因含量明顯高于非癌性乳腺組織。c-Fos基因可調控細胞的生長及凋亡，乳腺細胞長期接觸草酸鹽，通過促進c-Fos基因過度表達和細胞增殖能使正常細胞向癌細胞或肉瘤轉化，并且草酸鹽促進c-Fos基因過表達的這種作用只在乳腺細胞中存在，在其他含草酸鈣的細胞中并未發現c-Fos基因過表達。該研究也首次證明草酸鹽具有促進乳腺細胞增殖的作用，并且濃度越高，形成腫瘤的速度越快。在乳腺增生伴有鈣化的導管上皮也存在汗腺化生，異型汗腺化生有發展成乳腺癌的危險性，這應引起臨床醫師的注意[40-41]。目前研究認為，羥基磷酸鈣可以促進乳腺癌細胞遷移，而草酸鈣并不能增加乳腺癌細胞的遷移能力[3]。

總之，目前草酸鈣與乳腺癌關系的相關研究較少，并沒有直接證據證明草酸鈣與乳腺癌的發生、發展有密切關系，各個研究的結果也并不一致。以往大部分研究傾向于草酸鈣與乳腺良性疾病相關，與乳腺癌的形成及轉移無相關性，但近年來有部分研究表明草酸鈣與乳腺癌之間存在某種關聯，可能與乳腺癌的發生相關[27，40-41]。在上述草酸與鈣離子方面的研究中，草酸濃度的增加會促進內質網的氧化應激反應，從而進一步加快腫瘤的發展及細胞凋亡；而乳腺細胞中鈣離子的內穩態失衡導致鈣通道蛋白增加，鈣離子濃度增高，可促進腫瘤細胞的增殖及遷移。草酸及鈣離子濃度的上調均會增加乳腺癌發生的可能性，推測乳腺中草酸和鈣離子形成的草酸鈣晶體也可能與早期乳腺癌的發生相關，但這一推論有待進一步研究證實。

4 小 結

乳腺中草酸鈣的形成常被人們忽視。上述通過研究鈣離子、草酸根的轉運，以及借鑒腎結石中草酸鈣和乳腺癌中羥基磷酸鈣的形成機制為乳腺中草酸鈣的形成機制提供了一些線索。目前認為乳腺中草酸鈣的形成與頂漿上皮細胞化生有關。頂漿上皮細胞起源于乳腺末梢導管小葉單位，通過一系列鈣離子、草酸根離子的結合及轉運，主動分泌草酸鈣晶體，該晶體多存在于擴張導管中。這一觀點仍有待進一步實驗研究證實。乳腺腫瘤細胞中草酸鹽的含量明顯高于正常細胞，推測草酸鈣對乳腺癌的發生可能也有一定的相關性，因此研究乳腺中草酸鈣的形成可能有利于鑒別良惡性微鈣化，早期診斷乳腺癌。