雙膦酸鹽類藥物對骨肉瘤治療作用的研究進展

李昌全，許 彪

(昆明醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，昆明 650031)

雙膦酸鹽類藥物是化學治療性抗吸收化合物，以多種方式介導骨細胞的形態和活性，通過破骨細胞重塑來減輕骨吸收。目前雙膦酸鹽類藥物主要用于治療骨質流失過多的病癥，如腫瘤骨轉移、骨質疏松癥、惡性腫瘤相關的高鈣血癥和佩吉特病。骨是實體瘤患者最常見的轉移部位。雙膦酸鹽是一種治療和預防骨骼相關事件和保持住院患者生活質量的有效藥物。唑來膦酸是最有效的破骨細胞抑制劑，可用于治療骨轉移[1-2]。骨肉瘤是原發性骨癌最常見的組織學形式，約占所有原發性骨癌的20%[3-4]。骨肉瘤是兒童和青少年中最常見的原發性骨惡性腫瘤，占該人群原發性骨骼惡性腫瘤的一半以上[5]，骨肉瘤由類骨質或未成熟骨產生[6]。骨肉瘤以惡性程度高、生長迅速、早期轉移和預后不佳為主要特點，早期診斷困難，病死率和致殘率高[7]。原發性骨腫瘤細胞能夠破壞形成骨或軟骨組織，同時在骨組織中可以改變破骨細胞和成骨細胞形態，從而促進骨肉瘤形成。在原發性骨腫瘤轉移期間，破骨細胞、骨基質細胞、成骨細胞和癌細胞之間可能存在惡性循環。實際上，腫瘤細胞通過分泌破骨細胞活化因子來修飾骨組織微環境，如細胞因子(白細胞介素1、白細胞介素6、腫瘤壞死因子α)、激素(甲狀旁腺素相關蛋白)和成骨細胞因子(如骨形態發生蛋白、胰島素樣生長因子或Wnts)，其誘導成骨細胞和破骨細胞功能之間出現不平衡。受干擾的骨細胞直接將可溶因子或釋放因子分泌到細胞外基質中，刺激腫瘤生長[8-9]。現就雙膦酸鹽類藥物對骨肉瘤治療作用的研究進展進行綜述，為臨床上更好地治療頜骨骨肉瘤提供理論指導和依據。

1 雙膦酸鹽類藥物

1.1雙膦酸鹽 雙膦酸鹽是一種人工合成的內源性焦磷酸鹽類似物[10-11]，其分子遞送到骨骼增加的部位，可以增加骨形成[12]，已在臨床上廣泛應用，通常用于治療破骨細胞介導的骨疾病，包括骨質疏松癥、Paget病、惡性腫瘤相關的高鈣血癥、骨轉移和與多發性骨髓瘤有關的骨病[13-14]。雙膦酸鹽是一類強有力的骨吸收抑制劑[15]，近年來已成功用于骨骼并發癥、與骨質增生有關的骨質惡性骨疾病的治療以及碎屑性骨吸收，并已成為治療骨轉移的主要治療方法。雙膦酸鹽對骨礦物質有很高的親和力，并能夠干擾破骨細胞功能和抑制骨吸收[8,16]。雙膦酸鹽抑制骨降解和再吸收，降低骨更新率，其與破骨細胞數量的減少和剩余破骨細胞活性的抑制相關。破骨細胞活化是發生骨轉移的基本步驟。釋放疼痛化學介質是疼痛的重要機制，如通過釋放激肽、P物質和前列腺素刺激骨膜內感覺神經末梢。使用雙膦酸鹽可以減輕疼痛[12]。

雙膦酸鹽具有與天然焦磷酸鹽類似的結構，并可分為含氮和不含氮的雙膦酸鹽。含氮雙膦酸鹽包括阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽、伊班膦酸鹽、帕米膦酸鹽和唑來膦酸。不含氮的雙膦酸鹽包括依替膦酸鹽、氯膦酸鹽和替魯膦酸鹽。所有雙膦酸鹽通過附著于骨上的羥基磷灰石結合位點來抑制骨吸收，特別是在具有活性再吸收的區域，由于骨組織被破骨細胞吸收，嵌入骨中的雙膦酸鹽被釋放并降低破骨細胞骨吸收的能力[8,16]。含氮雙膦酸鹽通過抑制法尼基焦磷酸合成酶，促進破骨細胞與骨的附著。破骨細胞從骨表面脫離，從而抑制骨吸收。另一方面，不含氮的雙膦酸鹽在細胞內代謝成替代腺苷三磷酸的末端焦磷酸部分的底物，形成在細胞的能量代謝中與腺苷三磷酸競爭的非功能性分子。這一過程引發破骨細胞凋亡，導致骨破壞的減少。含氮雙膦酸鹽是較不含氮的雙膦酸鹽更有效的抗再吸收劑。此外，不含氮的雙膦酸鹽具有較高抑制骨礦化的潛力，可以引起骨軟化。因此，不含氮的雙膦酸鹽不再被廣泛使用。

雙膦酸鹽的不良反應包括急性期反應(10%～30%)，伴有肌痛、關節痛、頭痛和流感樣癥狀的短暫性發熱、短暫性低鈣血癥(18%)，低磷血癥(10%)，肌肉骨骼疼痛(≤6%)，脹氣(≤4%)，頭痛和胃食管反流病(3%)，便秘或腹瀉(≤3%)，腹痛(2%～7%)，食管潰瘍(2%)，反流(1%～5%)，腹脹、胃潰瘍、胃炎和肌肉痙攣(≤1%)[9]。

1.2唑來膦酸 唑來膦酸是最新一代的雙膦酸鹽，是破骨細胞介導的骨吸收抑制劑，可有效治療各種實體瘤患者的骨轉移，也是雙膦酸鹽家族中最有效的成員，用于減少患有骨轉移的各種惡性腫瘤患者的疼痛。在治療骨腫瘤中，比雙膦酸鹽更有效[9,17]。唑來膦酸是一種內源性焦磷酸的第三代含氮雙膦酸鹽類似物，與含鈣的羥基磷灰石骨礦物質結合緊密。唑來膦酸的血漿半衰期<24 h，但雙膦酸鹽在骨骼中穩定，骨骼半衰期超過300 d[18]，作為預防骨質疏松癥和某些類型骨轉移相關癌癥的骨骼并發癥標準治療[19-20]。唑來膦酸除有抗腫瘤轉移的潛能外，還具有直接或間接的免疫抗腫瘤作用，能阻斷腫瘤細胞黏附，使腫瘤細胞更容易受到化療的細胞毒作用，其機制包括損害遷移和侵襲、調節免疫反應和抗血管生成作用、抑制腫瘤增殖和誘導細胞凋亡。通常唑來膦酸通過抑制法尼基焦磷酸合成酶和香葉基焦磷酸合成酶導致抑制小GTP酶(如Ras、Rho和Rac)的異戊二烯化，而法尼基焦磷酸合成酶和香葉基焦磷酸合成酶是細胞增殖、遷移和侵襲所必需的合成酶。臨床前研究報道唑來膦酸可以預防體內骨肉瘤的肺轉移，其抗腫瘤作用是通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡、協同對細胞毒性劑的抑制作用、抑制血管生成、減少腫瘤細胞黏附于骨骼、減少腫瘤細胞的侵襲和遷移、解體細胞骨架和激活特定細胞抗腫瘤免疫反應實現的[20]。臨床證據表明,唑來膦酸可改善有骨和無骨癌癥患者長期生存的臨床試驗轉移效果[21-22]。

2 雙膦酸鹽類藥物在骨肉瘤中的應用

2.1雙膦酸鹽與骨肉瘤 雙膦酸鹽類似物可能通過改變破骨細胞膜的通透性或改變成熟破骨細胞吸收骨的能力來影響破骨細胞前體的分化和募集[23]。雙膦酸鹽已被證實具有抑制破骨細胞分化，促進骨形成的作用，研究發現其可以抑制頜骨吸收。雙膦酸鹽類似物還被證實通過以下方式抑制骨肉瘤的生長：①雙膦酸鹽抑制高度惡性骨肉瘤細胞的增殖并誘導細胞凋亡。②抑制腫瘤細胞血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A和VEGF受體1蛋白的表達，誘導高度惡性骨肉瘤細胞凋亡。含氮雙膦酸鹽(雙膦酸鹽和阿侖膦酸鹽)能夠降低內皮細胞系中的VEGF受體2表達，并抑制內皮細胞增殖和遷移。此外，雙膦酸鹽通過甲羥戊酸途徑，降低骨肉瘤細胞體外和體內侵襲性VEGF-A和VEGF受體1的表達。③通過對內皮細胞的直接抑制作用，抑制腫瘤誘導的血管生成。雙膦酸鹽不僅可通過抑制內皮細胞，減弱腫瘤誘導的血管生成和腫瘤生長，還可直接抑制骨肉瘤腫瘤細胞的增殖[9]。

甲氨蝶呤是一種有效的化療藥物治療腫瘤，能干擾DNA和RNA在S期的合成，使G1～S期相發生轉變，通過抑制劑-二氫葉酸還原酶，抑制或阻止細胞分裂并導致癌細胞凋亡。Yang等[24]通過體外實驗研究發現，用2 000 μg/mL或更多的甲氨蝶呤-二膦酸鹽綴合物處理24～96 h，MG63細胞的存活率顯著降低。用偶聯物處理的細胞在倒置相差顯微術和熒光染色下顯示凋亡，并且大多數細胞TUNEL檢測結果陽性。電子顯微鏡觀察到綴合物處理的細胞中染色質的核固縮和新月形聚集。用甲氨蝶呤雙膦酸鹽綴合物處理的MG63細胞流式細胞術顯示出細胞凋亡呈時間和劑量依賴性增加。甲氨蝶呤-雙膦酸鹽綴合物在靶向抗骨肉瘤治療中起關鍵作用，用高濃度綴合物處理可改變MG63細胞的形態，抑制骨肉瘤細胞MG63生長，誘導骨肉瘤細胞MG63發生細胞凋亡。

隨著雙膦酸鹽治療骨肉瘤的應用，雙膦酸鹽并發癥的報道逐漸增多，自2003年有研究第1次報道雙膦酸鹽引起頜骨壞死[25]以來，陸續有相關并發癥的報道[26-27]。

2.2唑來膦酸與骨肉瘤 唑來膦酸可以減輕骨疼痛，臨床前研究表明唑來膦酸通過直接的抗增殖作用、免疫激活和抗血管生成活性來抑制骨肉瘤的發生發展，骨肉瘤的特征是產生含有局灶性鈣的類骨質或未成熟的骨羥基磷灰石晶體沉積[28]。因此，唑來膦酸可能優先聚集在原發性骨肉瘤以及肺和骨轉移部位。唑來膦酸抑制法尼基焦磷酸合成酶的合成，是甲羥戊酸途徑中的關鍵酶，通過降低蛋白質異戊烯化作用抑制腫瘤生長[29]。骨吸收性破骨細胞因內化一定量的唑來膦酸功能容易受到抑制，廣泛用于減輕成人骨轉移性疼痛[30]。但含氮雙膦酸鹽可能具有對正常成骨細胞和各種腫瘤細胞(包括乳腺癌、骨髓瘤、胰腺癌和前列腺癌)的直接抗增殖和促凋亡作用[31]。唑來膦酸可減少骨肉瘤的動物模型中的原發性腫瘤生長，降低肺轉移率并提高存活率[32]。唑來膦酸還可與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白發揮協同抑制作用，降低鼠和人骨肉瘤細胞系的細胞增殖并抑制骨肉瘤腫瘤生長[18,33]。

唑來膦酸直接抑制人骨肉瘤細胞增殖并誘導體外細胞凋亡[34]。其中γδT細胞識別、細菌代謝產物相關的小磷酸抗原、類異戊二烯生物合成甲羥戊酸途徑均發揮關鍵作用[35]。唑來膦酸通過在雙膦酸鹽處理的細胞內累積甲羥戊酸途徑中間體，使腫瘤細胞對γδT細胞的細胞毒性敏感[36]。唑來膦酸促進骨肉瘤患者外周血單個核細胞γδT細胞的增殖，增強γδT細胞對人骨肉瘤細胞的細胞毒性[37]。VEGF-A和VEGF受體1在侵襲性骨肉瘤細胞中高表達，但在克隆性相關性較弱的侵襲性細胞系中不表達[9]。骨肉瘤患者血漿中VEGF-A水平通常升高，唑來膦酸可以降低骨肉瘤中VEGF-A的表達，并降低患者體內VEGF-A的循環水平[38]。此外，有證據表明，唑來膦酸通過VEGF-A和VEGF受體信號通路抑制自分泌刺激，部分誘導侵襲性骨肉瘤細胞凋亡[9]。因此，含氮雙膦酸鹽對骨肉瘤和腫瘤相關內皮細胞具有多效抑制作用。

含氮雙膦酸鹽類似物有對抗骨癌轉移的功效，表明含氮雙膦酸鹽類似物可降低溶骨性和成骨性疾病的發病率[39-40]。唑來膦酸和阿侖膦酸鹽以濃度依賴性的方式降低侵襲性骨肉瘤細胞系(K7M3和143B)的細胞活力和增殖。雙膦酸鹽還通過甲羥戊酸途徑調節骨肉瘤中VEGF-A和VEGF受體1表達，誘導高度惡性骨肉瘤細胞凋亡。唑來膦酸可抑制細胞增殖并在高度侵襲性的骨肉瘤細胞系中誘導細胞凋亡；唑來膦酸預處理還可抑制K7M3細胞的遷移，減緩體內骨肉瘤生長及腫瘤血管生成速度[9]。在體外研究中，唑來膦酸對骨肉瘤細胞能直接發揮抗治療作用，顯著減少骨肉瘤誘導的肺轉移[41-42]。唑來膦酸通過直接抑制破骨細胞生長和抑制破骨細胞活化劑在腫瘤中的表達，減弱骨肉瘤誘導的骨質溶解[43]。唑來膦酸通過Rho A活化、黏著斑激酶抑制的Jun激酶和p38途徑，阻斷香葉基香葉基化，抑制骨肉瘤細胞轉移，減弱骨肉瘤細胞遷移能力，抑制骨肉瘤細胞侵襲活性[44]。唑來膦酸可以通過降低CXC趨化因子受體4蛋白的表達和功能來削弱骨肉瘤的定向遷移能力[45]。唑來膦酸還可明顯降低LM8細胞基質金屬蛋白酶的分泌，抑制LM8細胞體外遷移、侵襲和黏附[46]。唑來膦酸通過激活胱天蛋白酶3抑制LM8細胞VEGF的表達，誘導LM8細胞發生細胞凋亡[47]。

體外實驗證實唑來膦酸對骨肉瘤細胞MG63有生長抑制作用，并且存在時間、劑量依賴關系，唑來膦酸與甲氨蝶呤具有協同作用[48]。Horie等[49]研究顯示，聯合唑來膦酸與紫杉醇或吉西他濱在小鼠骨肉瘤細胞中顯示出抗腫瘤作用。唑來膦酸聯合熊果酸可通過增強氧化應激和自噬有效誘導人骨肉瘤細胞凋亡[50]。L-MTP-PE(脂質體形式的胞壁酰基三肽磷脂酰乙醇胺)聯合唑來膦酸可顯著抑制原發性骨肉瘤肺轉移的進展[51]。曲妥珠單抗聯合唑來膦酸可增強Vγ9Vδ2T細胞對骨肉瘤細胞的細胞毒性，有治療骨肉瘤的潛力[52]。在唑來膦酸同步化療治療新診斷的轉移性骨肉瘤的可行性和劑量研究中發現，唑來膦酸可以安全用于轉移性骨肉瘤的化療，未來的研究有望確定唑來膦酸在骨肉瘤患者中的潛在益處[5]。Curtis等[53]研究發現，唑來膦酸聯合甲狀旁腺激素可改善骨質結構和強度。唑來膦酸顯示出在減少裂解引起的骨疼痛和改善骨微結構以及強度方面的潛力。Yamakawa等[54]研究顯示，在溶瘤病毒治療方面，唑來膦酸通過抑制抗凋亡蛋白和破骨細胞活化促進抗腫瘤、抑制腫瘤進展和預防骨質破壞的作用。體外研究發現,激光光化學療法能提高順鉑或唑來膦酸在良性和惡性骨細胞中的細胞毒性。這可能是針對腫瘤骨疾病(如骨肉瘤)的一種新的治療模式[55]。研究發現,阻斷熱激蛋白90激活和唑來膦酸協同作用，可以抑制骨肉瘤細胞增殖和轉移發展，最終延緩骨肉瘤進展[56]。

但隨著唑來膦酸的廣泛使用，雙膦酸鹽相關性頜骨壞死的發病率也越來越高[57-58]。一項唑來膦酸聯合化療和手術治療骨肉瘤的隨機多中心的Ⅲ期臨床試驗證明,唑來膦酸不宜用于骨肉瘤患者[59]。Lamoureux等[60]研究發現，唑來膦酸通過觸發熱激蛋白27和凝聚素等熱激蛋白的升高,提高骨肉瘤細胞存活率和增強抗藥性。

3 結 語

雙膦酸鹽和唑來膦酸在骨肉瘤治療中的應用不斷增多，其在骨肉瘤治療中的藥理作用也得到進一步證實。雙膦酸鹽類似物和唑來膦酸具有抑制破骨細胞分化，促進骨形成，抑制骨吸收的作用，但是其引起的雙膦酸鹽相關性頜骨壞死的發病率也越來越高[61-62]，同時也出現了一些對唑來膦酸治療骨肉瘤效果的質疑。頜骨骨肉瘤是最常見的口腔頜面部骨源性肉瘤，多見于兒童和青少年，病程進展快，可發生肺及腦的遠處轉移，預后較差[63]。99Tc-亞甲基二膦酸鹽也是雙膦酸鹽類似物的一種，能直接降低破骨細胞活性，促進骨形成，對癌癥原發灶也具有抑制作用[64-65]。深入研究99Tc-亞甲基二膦酸鹽對頜骨骨肉瘤的治療效果和機制將為拓展防治頜骨骨肉瘤提供新的思路和策略。