復元醒腦湯干預糖尿病腦梗死大鼠缺血腦組織血管新生的實驗研究*

孫麗華 葉苗青 沈俊逸 閆 詔 解婉瑩 方邦江（上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

目前糖尿病并發(fā)急性腦梗死的發(fā)病率、死亡率和復發(fā)率較高，預后不良。糖尿病是腦梗死的獨立危險因素，數(shù)據(jù)顯示糖尿病患者的腦梗死風險比非糖尿病患者高出1.5～3倍［1］。但是糖尿病性腦梗死的發(fā)病機制十分復雜，涉及許多信號通路，包括糖脂代謝影響、內皮功能、氧化應激以及炎癥反應等，迄今為止還尚未明確［2］。“復元醒腦法”治療中風病是龍華醫(yī)院急診科作為國家級重點專科學科內涵建設三大特色之一，臨床療效顯著。筆者在堅實的臨床基礎上，結合既往研究數(shù)據(jù)以及經驗總結，認為復元醒腦湯對于糖尿病腦梗死組織的修復應該是多靶點調控的，故以干預損傷區(qū)域血管微循環(huán)系統(tǒng)的重建為切入點，進行機制研究。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取150只健康的成年SD大鼠，雌雄各半，體質量（250±25）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司（實驗動物合格證編號2008001671284），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院科技樓實驗動物中心。

1.2 藥物 復元醒腦湯：人參10 g（另煎），三七10 g，石菖蒲 12 g，水蛭 10 g，益母草 30 g，天南星 15 g，制大黃9 g（后下）。由上海市龍華醫(yī)院制劑室生產提供，生藥質量濃度為388 g/L。二甲雙胍緩釋片由正大天晴藥業(yè)集團生產，國藥準字H20031104。尼莫地平由正大青春寶藥業(yè)有限公司生產，國藥準字H33022285。

1.3 儀器及試劑 大鼠腦立體定位儀，深圳瑞沃德生命科技有限公司生產。掃描儀，明基電通有限公司生產。紫外分光光度計，北京長流科學儀器公司生產。低溫高速離心機，Sanyo-Japan生產。恒壓恒流電泳儀，北京六一儀器廠生產。凝膠成像儀，mersham Pharmacia Biotech生產。-80℃冰箱，Sanyo-Japan生產。脫水機，石蠟包埋機，石蠟攤片機，切片機，Leica-German生產。光學顯微鏡，攝像系統(tǒng)，Olympus-Janpan生產。電泳儀，轉膜儀，BIO-BAD-USA生產。酶標儀，Thermo-USA生產。恒溫搖床，上海精密儀器制造公司生產。化學發(fā)光成像系統(tǒng)，上海歐翔科學儀器有限公司生產。鏈脲佐菌素（STZ），凝血酶，Sigma-USA 提供。PMSF，Amresco-USA提供。RIPA裂解液，Beyotime Biotechnology提供。BCA蛋白分析試劑盒，Amresco-USA提供。SDS-PAGE凝膠，SDS-PAGE上樣緩沖液，SDS-PAGE電泳液，定影液、顯影液，均由Beyotime Biotechnology提供。

1.4 模型制備 將STZ試劑溶于pH4.6的檸檬酸鈉緩沖液中（現(xiàn)配現(xiàn)用），大鼠腹腔注射STZ試劑（50 mg/kg），1周后制成糖尿病模型（隨機血糖＞16.7 mmol/L），并連續(xù)高脂飲食飼養(yǎng)2周。在此基礎上采用線栓法制備糖尿病腦梗死模型［3］。常規(guī)麻醉大鼠后，將大鼠以仰臥位固定于固定板上；剪去頸前的鼠毛，碘伏消毒，沿頸部正中部位切開皮膚和淺筋膜約2 cm左右。鈍性分離皮下組織，沿胸鎖乳突肌和頸前肌群肌間隙向深部分離，分離到氣管前肌后，沿右側胸鎖乳突肌腱向下分離，見到頸動脈鞘后可上拉鉤，分離動脈鞘，分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，結扎頸總動脈的近心端，夾閉頸總動脈，夾閉頸內動脈并從頸內動脈插入線栓，然后進入頸外動脈直至進入中腦動脈，插入深度距頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈分叉約為18 mm。將線栓和頸外動脈通過縫線結扎并固定。將頸內動脈緊緊夾緊并切除額外的線栓線。成功后在線栓入口處結扎，縫合。縫合后，用酒精棉簽消毒皮膚縫合線，將大鼠放回籠中，并在2 h后拉動線栓進行再灌注。在糖尿病組中，除未插入線栓之外，其余的手術過程與用于制備腦梗死模型的手術過程相同。

1.5 分組及給藥 健康SD大鼠150只，在常規(guī)喂養(yǎng)后隨機分為正常組30只與糖尿病模型組120只，糖尿病模型造模成功后，連續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)2周，再將糖尿病模型組按每組均等例數(shù)隨機分為糖尿病模型假手術組（簡稱糖尿病組，予正常飼養(yǎng)+0.9%氯化鈉注射液）；糖尿病腦梗死大鼠模型組（簡稱模型組，予正常飼養(yǎng)+0.9%氯化鈉注射液）；糖尿病腦梗死大鼠模型中藥灌胃組（簡稱中藥治療組，予正常飼養(yǎng)+復元醒腦湯）；糖尿病腦梗死大鼠模型西藥灌胃組（簡稱西藥治療組，予正常飼養(yǎng)+西藥）4組。中藥治療組大鼠給予復元醒腦湯劑量 10.4 g/（kg·d），每日 2次。西藥治療組大鼠予二甲雙胍 27 mg/kg，每日 2 次；尼莫地平 2.16 mg/（kg·d），每日2次（具體實驗步驟和劑量參照陳琦的《中藥藥理實驗方法學》［4］根據(jù)實驗動物與體表面積的比值計算）。同時，模型組和糖尿病組給予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。正常組未進行干預，僅予常規(guī)喂養(yǎng)。連續(xù)灌胃14 d后處死取材。

1.6 標本采集與檢測 1）大鼠血糖測量。通過大鼠尾靜脈收集血液，并使用葡萄糖計和葡萄糖測試條在術前、術后7 d測量血糖水平。2）神經功能評分。各組術后24 h和7 d實驗動物進行Bederson評分：尾部抬高使大鼠懸于空中測試，在大鼠的尾巴舉起高度1 m處的狀態(tài)下觀察前肢的屈曲。0分為無缺陷。1分為對側前肢屈肌功能缺損。2分為尾部握住時，對側推和軀干轉向同側的阻力降低。3分為受影響側旋轉非常明顯，受影響側負重能力降低。4分為動物很少自發(fā)活動，喜歡躺下或休息。當分值大于或者等于1分的時候，表明實驗動物模型制作成功。3）免疫組織化學染色檢測大鼠新生血管的密度檢測。新生血管的標記CD31進行免疫組織化學染色，石蠟包埋組織4 μm切片，常規(guī)二甲苯脫蠟。采用兔CD31免疫組化試劑盒，按說明書進行操作。3%過氧化氫溶液封閉約10 min，PBS液沖洗3次，每次3 min，正常羊血清工作液37℃封閉30 min，傾去工作液，滴加一抗4℃孵育過夜（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照），PBS液沖洗3次，每次3 min，滴加二抗，37℃孵育15 min，PBS液沖洗3次，每次3 min，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶，37℃孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，樹膠封片。陽性細胞呈棕黃色至褐色。4）透射電鏡檢測大鼠腦組織皮層的微血管超微結構。每組各取2只大鼠，深度麻醉后，置冰上迅速斷頭取腦，沿視交叉處前后1 mm切開，在缺血梗死周圍皮質取大約1 mm3（1 mm×1 mm×1 mm）組織，置入4℃2.5%戊二醛固定液中約2 h，配制0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次并固定2 h或更長時間，4℃保存，移入1%鋨酸固定液中固定2～3 h，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次。經脫水、包埋、固化、超薄切片機50～60 nm切片、3%醋酸鈾-枸櫞酸鋁雙染色、透射電鏡觀察并拍片。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)統(tǒng)計應用版本為Windows v.17的SPSS統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析，組間的差異性檢測post hoc分析采用LSD-t。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血糖水平比較 見表1。術前糖尿病組、模型組、中藥治療組和西藥治療組大鼠與正常組比較，血糖均升高（均P＜0.01）。術后7 d中藥治療組與模型組比較，血糖降低（P＜0.05）；西藥治療組與模型組比較，血糖亦降低（P＜0.05）。中藥治療組與西藥治療組比較，差別不大（P＞0.05），表明無論是復元醒腦湯的中藥治療還是西藥治療均能降低血糖水平。

表1 各組大鼠術前術后血糖比較（mmol/L，x±s）

2.2 各組大鼠Bederson評分比較 見表2。手術后7 d正常組和糖尿病組大鼠Bederson評分為0分；模型組、中藥治療組和西藥治療組與正常組比較，Bederson評分均升高（均P＜0.01），表明與模型組、中藥治療組和西藥治療組大鼠仍有一定程度的神經缺損。中藥治療組、西藥治療組與模型組比較，Bederson評分均降低（均P＜0.01）；中藥治療組與西藥治療組Bederson評分比較，差別不大（P＞0.05），表明無論是復元醒腦湯的中藥治療還是西藥治療均能顯著改善糖尿病腦梗死所導致的神經缺損。

表2 各組大鼠Bederson評分比較（分，x±s）

2.3 各組大鼠缺血腦組織部位血管新生變化 見圖1。正常組血管豐富，血管壁較厚，管腔充滿；糖尿病組血管管壁較薄，管腔較厚，血管數(shù)量少，管腔受損。西藥治療組血管壁增厚。中藥治療組壁增厚有一定程度的血管生成，管腔增加。結果表明，中藥治療組和西藥治療組均對糖尿病性腦梗死的血管生成有影響，中藥治療組優(yōu)于西藥治療組。

圖1 各組腦微血管內皮細胞CD31的表達（免疫組化染色，400倍）

2.4 各組大鼠腦皮層微血管超微結構的變化 見圖2。使用透射電鏡檢測各組血管的基底膜狀態(tài)。結果表明，糖尿病組、正常組大鼠未見水腫及結構破壞，但糖尿病組存在基底膜變薄現(xiàn)象；糖尿病組大鼠出現(xiàn)基底膜節(jié)段性不清甚至溶解、缺損，管腔縮小；中藥治療組、西藥治療組大鼠腦微管超微結構的變化整體較糖尿病組有所改善。

3 討 論

腦梗死是嚴重危害人類健康的主要疾病之一，臨床數(shù)據(jù)顯示糖尿病會增加罹患腦缺血的風險，例如缺血性腦卒中或心血管疾病［5-6］。糖尿病能加重腦血管疾病造成的損害，包括氧化應激，白細胞功能受損，增加血腦屏障的滲透性以及炎癥反應等一系列的血管病變，包括增加血管通透性而大大增加缺血性中風的發(fā)病率［7］。事實上，腦梗死發(fā)生時，腦組織由于血管舒張功能受損導致腦血流量持續(xù)下降而引起神經細胞死亡，機體將通過血管再生對缺血半影區(qū)進行調節(jié)及重建功能性微血管系統(tǒng)從而維持神經功能，并且為神經元可塑性創(chuàng)造一個良好的微環(huán)境以利于其功能恢復［8］。

圖2 各組腦微血管超微結構的比較（3%醋酸鈾-枸櫞酸鋁雙染色，10 000倍）

近年來，業(yè)界普遍認同糖尿病腦梗死消渴并中風病病機主旨在于 “氣虛為其根本、標瘀痰阻絡為其標實”，消渴并中風病的基本治則以“補虛活血、祛痰通絡”為主。方邦江教授根據(jù)臨床中“消渴中風病”的病機特點，總結前人治療急性腦血管病的經驗，創(chuàng)新性提出了“復元醒腦法”，以培植元氣為根本大法，以逐瘀泄痰、祛熱息風、通絡為輔，并自擬復元醒腦湯（人參、石菖蒲、天南星、三七、水蛭、益母草、大黃）治療中風病取得良好臨床療效。方中人參培補中元之氣，補益脾肺清氣，為治本之君藥；天南星息風清熱，定驚化痰；石菖蒲性芳香化濁祛痰、開腦竅，天南星與石菖蒲相互配合共為臣藥治療風痰交阻腦竅之癥；三七與水蛭并用為臣藥活血止血，力專善走竄，周行全身經絡。益母草為佐藥尤擅活血利水祛風，方小力專；大黃為使，清熱兼解毒，通腑瀉下化瘀，使瘀、痰、熱、風等有形和無形實邪得以出路；諸藥合用，共奏醒腦復神、逐瘀泄痰、祛熱息風之功。實驗研究顯示，復元醒腦湯能夠治療中風病的機制可能在于在腦梗死中可調整胰島素敏感相關指數(shù)，干預胰島素抵抗這一難題。有效保護和減少再灌注損傷對血-腦屏障造成的二次打擊和傷害，降低血-腦屏障的通透性，緩解腦水腫病變進展的程度，減輕大腦皮層神經細胞的腫脹程度，減輕微血管內皮細胞的損傷，改善炎性細胞浸潤，進而改善神經缺損行為評分，促進建立損傷區(qū)域局部神經與血管的新生和側支循環(huán)重建［9-15］。

本次實驗筆者通過大鼠血糖水平、Berderson評分、透射電鏡觀察各組血管基底膜狀態(tài)等方面綜合評估糖尿病并發(fā)腦梗死動物模型。結果證實復元醒腦湯和西藥組均改善了糖尿病腦梗死大鼠的血糖水平，糖尿病腦梗死的主要病理特征是由于供血不足所導致的組織梗死以及梗死中心周圍組織的缺氧缺血，所以重建血管以恢復血液循環(huán)對于腦梗死后的糖尿病缺血性腦組織十分重要。CD31作為血管內皮細胞新生的重要標志［15］，通過免疫組化染色顯示糖尿病腦梗死組織血管管壁斷裂，內皮細胞受損，管腔縮小，復元醒腦湯治療后，糖尿病腦梗死大鼠缺血區(qū)新生血管數(shù)增多，血管壁較完整，血管直徑增厚。除此之外，筆者使用透射電鏡檢測了各組血管基底膜狀態(tài)，可以觀察到糖尿病組、正常組大鼠血管結構未見明顯破壞，但糖尿病組存在基底膜變薄現(xiàn)象；模型組大鼠出現(xiàn)基底膜節(jié)段性不清甚至溶解、缺損，管腔縮小；中藥治療組、西藥治療組大鼠腦微管超微結構的變化整體較糖尿病組有所改善。基于上述結果筆者認為復元醒腦湯能降低糖尿病腦梗死大鼠模型的血糖水平，能夠上調血管內皮CD31的表達，促進血管生成，改善腦微血管超微結構，從而緩解糖尿病合并腦梗死進展，改善大鼠神經功能缺損行為評分，為臨床工作提供了重要參考，具有廣泛的應用前景和非常重要的科學研究意義。