短波單胞菌（Brevundimonas sp.）A1A18對堿性土壤毒死蜱污染的修復

顧 欣，劉艷薇，王新譜，孫權，王銳，虎芳芳，陳燕，賈彥霞

寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021

毒死蜱屬于有機磷類神經毒劑，兼具觸殺和胃毒作用（農業部農藥檢定所，1989），以百余種作物害蟲為靶標，毒殺效果好（Kenaga et al.，1965），成為農業生產中應用最廣泛的殺蟲劑之一。隨著毒死蜱用量及使用面積的增加，其生態毒性越來越受到人們關注。毒理試驗表明，低濃度毒死蜱可影響人類大腦的發育和功能，抑制核酸和蛋白質合成（Slotkin，1995）。高濃度毒死蜱可導致人體呼吸系統麻痹，甚至死亡（Hancock et al.，2007；Hulse et al.，2014）。栽培過程中，毒死蜱通過撒播、淋溶等方式進入土壤，促使該農藥在植株體內積累，通過生物富集作用，直接威脅人類、其他生物的健康安全。目前，部分歐美國家已在某些領域全面禁用毒死蜱（Rauh et al.，2015；Centner，2018）。中國農業部宣布于2017年1月1日起在蔬菜上禁止使用毒死蜱。然而，該農藥仍被允許用于水稻、小麥、棉花、果樹、花生和甘蔗等作物的栽培中，加之土壤中的毒死蜱殘留在短期內無法徹底降解，半衰期最長達數百天（Chai et al.，2013），仍然有進入食物鏈的可能性，對農業生態安全具有潛在威脅。

利用微生物降解農藥殘留，是一種環保、高效、低成本的生物修復方式，被證明是從土壤環境中消除有機磷農藥的最可行且有效的選擇。如利用黃桿菌（Flabnobacterium sp.）、節桿菌（Arthrobacter sp.）、糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鞘胺醇單胞菌（Sphingomonas sp.）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）和蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）等細菌降解土壤、水體中的毒死蜱殘留，降解率最高接近 100%（Shamsa，2016；Khalid，2016；Feng，2017；李曉慧等，2007；段海明，2012）。筆者從寧夏土壤中分離篩選出一株毒死蜱降解菌，經形態學、生理生化（東秀珠等，2002）和基因測序，將其鑒定為短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）A1A18，NCBI編號為MK110476。該屬細菌曾被發現對多種有機磷農藥具有降解作用（Deshpande et al.，2004；Chanika et al.，2011；Li et al.，2008）。

土壤中毒死蜱的降解速率除了與農藥初始質量濃度有關，還與復雜的土壤性質，如酸堿度、溫度、濕度、質地、有機質含量、微生物活性和數量等密切相關（Singh et al.，2003；Getzin et al.，1981；Racke et al.，1996；Das et al.，2015）。研究表明，無機肥或有機肥對土壤微生物和降解菌的活性具有顯著促進作用，繼而促進對目標降解物的降解（Das et al.，2015；Zhang et al.，2012；Chen et al.，2015）。然而，二者配施對農藥降解率及施藥后土壤微生物的影響鮮見報道。

為此，本研究在探究毒死蜱降解菌短波單胞菌A1A18菌株對堿性砂壤中毒死蜱降解動態的基礎上，進一步研究不同肥料與降解菌配施、不同濃度降解菌劑對土壤毒死蜱殘留降解動態的影響，以及降解菌施用對土壤微生物的影響，以期為堿性土壤毒死蜱污染的微生物修復研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試溫室及土壤

試驗地點位于寧夏大學農科試驗基地。試驗土壤來自銀川市軍馬場未施用過毒死蜱的農田，取 0－20 cm的表層土，剔除其中的石塊與植株殘體，自然風干，過2 mm篩。一部分用于毒死蜱加標回收試驗和盆栽試驗；另一部分用于土壤基本理化性質測定。試驗土壤為干旱土土綱，正常干旱土亞綱，鈣積正常干旱土土類，質地砂壤，基本理化性質如表1。

表1 試驗土壤基本理化性質Table1 Physicochemical properties of the tested soil

1.2 試驗材料

黃瓜品種為津優35號。40%毒死蜱乳油（永農生物科學有限公司“巨雷”牌），原藥質量分數為39.6%，推薦劑量為1500 mL·hm-2。毒死蜱標準品為色譜純。

毒死蜱降解菌為短波單胞菌A1A18，由寧夏大學農業資源與環境實驗室從毒死蜱污染土壤中分離篩選獲得。

有機肥為羊糞基有機肥，主要原料為羊糞和秸桿，有機質質量分數45.7%，全氮、全磷、全鉀的質量分數分別為28、11、15 g·kg-1。尿素為分析純（AR），粉狀。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與增殖

從菌種管中挑取單菌落，劃線接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上，37 ℃恒溫倒置培養16－18 h。挑取活化后的菌落，接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養 16－18 h，檢測菌液濃度后，用無菌生理鹽水稀釋，制成有效活菌數為2.0×108CFU·mL-1的菌懸液，備用。

1.3.2 試驗1

設置滅菌土（A1）、滅菌土+滅活降解菌（A2）、滅菌土+降解菌（A3）、未滅菌土（A4）、未滅菌土+滅活降解菌（A5）、未滅菌土+降解菌（A6）6個處理。取部分試驗土壤和菌懸液，于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，制備成滅菌土和滅活降解菌。在滅菌土和未滅菌土中分別拌入毒死蜱 800倍稀釋液，用量為5 mL·kg-1（干土，下同），制備成污染土。將相同濃度的已滅活和未滅活的菌懸液分別與兩種污染土充分混勻，使A3、A6處理土壤中降解菌密度為4×107CFU·g-1（干土，下同）。將土壤分裝至營養缽（上口直徑16 cm，底直徑11 cm，高14 cm），裝量為每缽1.0 kg，添加無菌水，使土壤含水量保持在20%。試驗期間，根據日蒸發量補充無菌水。每處理設置10個重復。于施藥后第0（施藥后4 h）、1、3、5、7、14、21天分別取各處理0－10 cm深度的土壤樣品。采用多點混合取樣法采集土樣，每處理取混合土樣10 g，立即帶回實驗室，檢測各處理土壤樣品中的毒死蜱殘留量。

1.3.3 試驗2

將不同肥料、降解菌與未滅菌土混合，設7個處理，分別為添加尿素（B1）、有機肥（B2）、尿素+降解菌（B3）、有機肥+降解菌（B4）、尿素+有機肥+降解菌（B5），以不施肥只加降解菌為對照（B0），以不施肥不加菌為絕對對照（CK1）。土壤中尿素和有機肥的質量分數分別為0.2%和1%。將菌懸液與土壤充分混勻，使降解菌密度為4×107CFU·g-1。將土壤分裝至營養缽中（同1.3.2）。每缽移栽1株三葉一心期、健康的黃瓜苗，培養 3 d。待植株適應后，選取長勢均一的瓜苗，用小型噴灑器將 5 mL毒死蜱800倍稀釋液均勻噴施于缽中土壤，不沾染葉片。每處理30株。于施藥后第0（施藥后4 h）、1、3、5、7、14、21天分別取各處理0－10 cm深度的根周土壤樣品。采用多點混合取樣法采集土樣，每處理取混合土樣10 g，立即帶回實驗室，檢測各處理土壤樣品中的毒死蜱殘留量。

1.3.4 試驗3

在自然土中添加 1%有機肥和不同數量的降解菌，設置6個處理，土壤中降解菌的初始密度分別為 2×107（C1）、4×107（C2=B4）、6×107（C3）、8×107CFU·g-1（C4），以不施降解菌為對照（C0=B2），不施毒死蜱不施菌為絕對對照（CK2）。土壤分裝、瓜苗移栽、毒死蜱噴施和取土樣方法同1.3.2。每處理 30株。一部分根周土壤樣品用于檢測毒死蜱殘留量；另一部分根周土壤樣品用于檢測土壤微生物數量。

表2 堿性土壤中毒死蜱的加標回收率Table2 Recovery of standard addition of chlorpyrifos standard in alkaline soil

1.4 測定方法

菌體濃度：采用平板傾注法。取搖勻的 1 mL待測菌液，用無菌生理鹽水進行適量稀釋。將1 mL稀釋菌液注入無菌培養皿中，倒入約 50 ℃的牛肉膏蛋白胨固體培養基，與菌液混勻，靜置，冷凝后倒置于37 ℃恒溫箱中培養24 h，對菌落進行計數。每個濃度梯度設置3個重復，計算菌液的活菌濃度。

土壤理化性質：含水量檢測采用烘干法；pH值檢測采用電位法；有機質檢測采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法（鮑士旦，2000）。

土壤中毒死蜱殘留量檢測：從土壤中提取毒死蜱（Fang et al.，2006），采用氣相色譜分析法進行檢測。儀器條件為 Agilent 7980A-ECD；色譜柱HP-5石英毛細柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；進樣口溫度220 ℃，檢測器溫度320 ℃；程序升溫測定，初始柱溫80 ℃保持1 min，以15 ℃·min-1上升至 150 ℃保持 2 min，再以 6 ℃·min-1上升至270 ℃保持 2 min；載氣為高純氮氣（純度99.999%），流速為1.0 mL·min-1。進樣方式為不分流進樣，進樣體積為 1 μL。采用外標法計算土壤樣品中毒死蜱的殘留量。

土壤微生物數量：鮮土樣過篩（1 mm），采用土壤懸液稀釋平板計數法檢測土壤中可培養微生物的數量。使用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基和高氏I號培養基分別進行細菌、真菌和放線菌的選擇性培養（沈萍等，2007）。

1.5 毒死蜱加標回收試驗

取土壤樣品，添加毒死蜱標準品，混合均勻，制成毒死蜱質量分數分別為 0.1、0.5、1.0、5.0 mg·kg-1的施藥土壤，每個處理設置5個重復，以不添加毒死蜱為空白對照。按照1.4方法步驟檢測土壤中毒死蜱殘留量，計算其加標回收率。

1.6 統計分析

運用Excel 2010和Origin 9.0軟件處理數據和繪圖；運用Origin 9.0進行農藥降解動力學方程擬合；運用SPSS 17.0軟件進行方差分析，在P＜0.05水平上進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 堿性砂壤中毒死蜱加標回收率

毒死蜱在堿性土壤樣品中的加標回收率和相對標準偏差如表2所示。空白對照中未檢測出毒死蜱殘留。毒死蜱在堿性土壤樣品中的平均加標回收率為91.04%－100.70%，相對標準偏差為1.91%－4.42%。表明該方法檢測堿性土壤中的毒死蜱，回收率高，相對標準偏差小，符合《農藥殘留試驗準則》（劉光學等，2004）中農藥殘留檢測加標回收率70%－110%的要求。

2.2 堿性土壤中毒死蜱的降解動態

毒死蜱的降解動態特征如圖1所示。施藥后，隨著時間的延長，土壤中的毒死蜱殘留量呈降低趨勢。其降解過程可分為兩個階段。初始階段，即施藥后至第5天，為快速降解期。滅菌土中添加降解菌（A3），毒死蜱殘留的質量分數由2.505 mg·kg-1降至1.437 mg·kg-1，降解率為42.63%。未加菌的滅菌土（A1）中，毒死蜱殘留的質量分數由 2.527 mg·kg-1降至 1.670 mg·kg-1，降解率僅為 33.91%。滅菌土加滅活菌（A2）中，毒死蜱殘留的質量分數由 2.518 mg·kg-1降至 1.675 mg·kg-1，降解率為33.38%。未滅菌土中添加降解菌（A6），毒死蜱殘留的質量分數由 2.439 mg·kg-1降至 0.902 mg·kg-1，降解率為 63.02%。但是，該階段未滅菌土不加菌（A4）和未滅菌土加滅活菌處理（A5），毒死蜱降解率分別僅為38.72%和39.00%。說明土壤微生物參與下的毒死蜱生物降解速率顯著高于非生物降解速率，降解菌的施用可顯著加速毒死蜱的降解。無論是滅菌土還是未滅菌土，添加滅活菌對土壤毒死蜱降解的影響與未添加處理均無顯著差異。隨著時間延長，土壤毒死蜱殘留量的變化曲線趨于平緩，降解過程逐漸進入慢速階段。

圖1 滅菌和未滅菌堿性土壤中添加滅活、未滅活降解菌對毒死蜱殘留量的影響Fig.1 Effects of inactivated and active degrading bacteria on chlorpyrifos residues in autoclaved and non-autoclaved alkaline soil

利用一級動力學模型（孔德洋等，2014）對毒死蜱在堿性土壤中的降解過程進行擬合：

式中，t為采樣距離施藥的時間差，d；Ct為經t時間降解的毒死蜱殘留量，mg·kg-1；C0為施藥后毒死蜱的初始沉積量，mg·kg-1；k為降解速率常數，d。由表3可知，決定系數R2為0.9775－0.9872，均大于0.9500，試驗濃度下的毒死蜱在堿性土壤中的降解符合一級動力學模型。

試驗結果表明，毒死蜱在滅菌土壤中的降解速率明顯低于未滅菌土壤，在未添加降解菌土壤中的降解速率顯著低于添加降解菌土壤。至施藥后第21天，無菌土 A1和 A2處理的毒死蜱降解率僅為68.98%和71.09%，半衰期分別為10.74 d和10.30 d。滅菌土加降解菌（A3）的毒死蜱半衰期為7.04 d。有菌土（A4）的降解率為76.40%－88.81%，半衰期為 4.09－8.17 d。土壤中天然生存著大量土著微生物，可分解利用土壤中的碳源、氮源、無機鹽等物質，并成為土壤自身凈化能力的主要生物因素。滅菌土壤與未滅菌土壤相比，毒死蜱殘留降解速率顯著下降，半衰期延長，表明土壤中的土著微生物對毒死蜱具有一定降解能力。土壤中添加毒死蜱降解菌，顯著提高了土壤中毒死蜱的降解速率，縮短了半衰期，說明無論是土著微生物還是施加降解菌對毒死蜱的降解均具有顯著促進作用。其中，滅菌土添加降解菌（A3）的毒死蜱降解率比未滅菌土（A4）的稍高，但差異未達到顯著水平，說明單獨依靠土著微生物或降解菌 A1A18，對土壤中毒死蜱的降解作用均是有限的。土壤中添加滅活菌對毒死蜱半衰期的影響與不添加處理無顯著差異。降解菌作為生物體，添加量較少，故土壤中有機物含量變化幅度較小，對土壤中毒死蜱的吸附和降解無顯著影響。

表3 堿性土壤中毒死蜱降解的動力學方程與半衰期Table3 Dynamics equation and half-life of chlorpyrifos degradation in alkaline soil

表4 尿素、有機肥與降解菌的不同配施處理下堿性土壤中毒死蜱降解的動力學方程與半衰期Table4 Dynamics equation and half-life of chlorpyrifos degradation in alkaline soil of different fertilization treatments of urea, organic fertilizer and degrading bacteria

2.3 不同施肥處理對堿性土壤中毒死蜱降解動態的影響

為接近實際耕作條件，試驗2采用噴施法施用毒死蜱。由表4可知，該噴施方法使表層0－10 cm土壤中毒死蜱的初始質量分數為 2.508－2.592 mg·kg-1，略高于試驗 1土壤混勻法（2.499－2.506 mg·kg-1）。

施藥后，隨著時間延長，各處理的土壤毒死蜱殘留量逐漸下降，通過一級動力學模型計算出的半衰期具有差異。由圖2可知，在毒死蜱快速降解期，單施 0.2%尿素（B1）、1%有機肥（B2）的毒死蜱降解率分別為41.46%和42.73%，降解速率常數為0.085和 0.090，較未施肥 CK1的農藥降解率（38.36%）和降解速率常數（0.082）有所提高，且二者之間無顯著差異。施用降解菌各處理，無論是否與肥料配施，均對毒死蜱的降解具有顯著促進作用。單施降解菌B0，降解菌與肥料配施的B3、B4、B5降解率分別為57.32%，69.08%、74.55%、72.89%，降解速率常數為0.148，0.221、0.252、0.257，顯著高于CK1和單一施肥處理。與單施降解菌B0比較，降解菌與不同肥料配施對毒死蜱的降解具有更強的促進作用。因此，圖2中毒死蜱的降解動態可分為3組。第1組最慢，包括未施肥CK1和單施肥的B1、B2，半衰期為7.73－8.17 d；第2組為單施菌的B0，半衰期為4.69 d，降解較快；第3組為降解菌與肥料配施的B3、B4和B5，半衰期為2.69－3.13 d，降解最快。可見，將尿素、有機肥與降解菌配施可顯著提高土壤中毒死蜱的降解速率。在堿性土壤中施用 0.2%尿素、1%有機肥，對土壤酸堿度調節，有機質含量、速效養分提升等方面具有積極的影響，可以促進土著微生物和降解菌的代謝，與未施肥處理相比，加速了土壤中毒死蜱的降解，對堿性土壤毒死蜱污染具有較好的消除作用。

圖2 尿素、有機肥與降解菌的不同配施處理對堿性土壤中毒死蜱殘留量的影響Fig.2 Effects of different fertilization treatments of urea, organic fertilizer and degrading bacteria on chlorpyrifos residues in alkaline soil

表5 降解菌不同施用量對堿性土壤中毒死蜱殘留量的影響Table5 Effects of different application rates of degrading bacteria on chlorpyrifos residue in alkaline soil mg·kg-1

2.4 降解菌不同施用量對堿性土壤中毒死蜱降解動態的影響

堿性土壤中施用不同數量的降解菌 A1A18，毒死蜱殘留的降解動態具有差異。如表 5所示，施菌各處理的毒死蜱殘留量較未加菌的CK0減少。施藥后第 1天，除最低施用量（初始菌落密度為 2×107CFU·g-1）C1的農藥殘留量與C0無顯著差異外，其他各處理均顯著低于C0。隨著降解菌對環境的適應和降解作用的發揮，施藥后第 3－21天，各處理的農藥殘留量均顯著低于CK0。尤其在第3－14天，土壤毒死蜱殘留量與降解菌施用量呈反比。最低施用量 C1處理，毒死蜱一級動力學方程為Ct=2.573e-0.159t，半衰期為4.33 d；C2的半衰期為2.74 d。施用降解菌的初始密度分別為 6×107CFU·g-1（C3）和8×107CFU·g-1（C4）的處理毒死蜱降解速率最快，半衰期分別為1.87 d和1.70 d，至施藥后21 d，降解率分別達到90.71%和91.65%，差異不顯著。由此可知，堿性土壤中毒死蜱殘留降解的快慢與降解菌施用量在一定范圍內具有相關性。

2.5 降解菌不同施用量對堿性土壤微生物的影響

施用農藥后，土壤中的可培養細菌、真菌和放線菌的數量受到不同的影響。施用不同濃度的降解菌，對土壤微生物也具有一定的影響，如圖3所示。

試驗環境涉及毒死蜱和作物栽培、有機肥的施用，因此，土壤細菌數量變化是多因素綜合表現的結果，如圖3A所示。未施用毒死蜱的CK2，由于作物生長和有機肥雙重影響，土壤細菌數量呈增加趨勢。施用毒死蜱后，C0的細菌數量顯著下降，至第5天較對照降低65.14%。隨后，細菌數量緩慢回升，至第 21天恢復至正常水平。加降解菌的各處理，土壤細菌數量在前期均表現為不同程度的下降。隨著時間延長，各處理的細菌數量趨于穩定。添加降解菌數量越大，土壤中細菌總數越多，且都高于CK2的水平。

圖3 降解菌不同施用量對堿性土壤中可培養細菌（A）、真菌（B）和放線菌（C）數量的影響Fig.3 Effects of different application rates of degrading bacteria on the number of culturable bacteria (A), fungi(B) and actinomycetes (C)in alkaline soil

施藥后1 d，土壤真菌數量較CK2顯著增加，如圖 3B 所示，增幅大小順序為：C0＞C1＞C2＞C3＞C4，其中單施農藥未施降解菌的 C0增幅最高（26.05%）。隨著降解菌施用量的增加，C1至C4處理增幅逐漸減小，分別為21.01%、15.97%、13.45%和7.56%。說明細菌型降解菌的施用，對土壤真菌數量的增加具有一定抑制作用。土壤真菌大量增加的持續時間較短，到第 3－5天各處理已基本恢復至初始水平。隨著施藥后天數的增加，真菌數量呈緩慢降低的趨勢，至21 d，各處理的土壤真菌數量與對照組無顯著差異。

如圖3C所示，施用毒死蜱后，土壤放線菌的數量變化可分為3個階段。第1個階段是施藥后至第1天，放線菌受到抑制而數量下降。第2階段，第 2－7天，在毒死蜱的刺激下，放線菌數量快速增長至最高值。比較第7天的放線菌數量，未加菌C0較 CK2增加了31.51%，而加菌各處理較 CK2增加了37.68%－48.06%，即隨著降解菌施用數量的提高，放線菌數量有增加的趨勢。隨后進入第3階段，放線菌數量緩慢下降，至21 d各處理均降至對照水平。放線菌數量的增加，可能是因為其他微生物數量下降，為其提供了更多的生存空間；或是受堿性環境中毒死蜱及其分解產物的刺激，出現增殖現象，相關機制有待進一步研究。

3 討論

試驗用土壤樣品為堿性砂壤，有機質含量低，組成成分較為簡單，毒死蜱在其中的平均加標回收率為91.04%－100.70%，相對標準偏差≤4.42%，表明試驗方法的準確度、精確度可用于檢測堿性砂壤中毒死蜱的殘留量。

毒死蜱是二烷基磷酸酯類農藥，其水解反應是親核加成反應，反應速度隨著介質中 OH-基團濃度的增加而增加。因此，毒死蜱在中性和弱酸性環境中較為穩定，而在堿性環境中易降解（方華，2007）。試驗結果表明，毒死蜱在堿性土壤中的降解包括非生物降解過程和生物降解過程，后者主要是土壤微生物作用，與已有研究結果一致（Chishti et al.，2013）。從動力學角度分析，在pH為8.57的強堿性土壤中，毒死蜱的降解過程符合一級動力學方程，由模擬方程可知毒死蜱的半衰期，非生物降解過程為10.74 d，生物降解與非生物降解綜合過程為8.17 d。Racke（1996）研究表明，不同土壤中毒死蜱的半衰期差異很大，土壤的物理、化學和生物學性質都會影響其降解速率，同樣是砂壤，堿性環境中的毒死蜱半衰期顯著低于酸性和中性環境，半衰期為17－126 d。李界秋等（2007）在pH為6.02的酸性砂壤土施用毒死蜱，其半衰期僅為9.8 d。由于試驗土壤和試驗條件等各方面均存在差異，如土壤機械組成、酸堿度、含水率、微生物類群和底物初始質量濃度、光照條件、是否種植作物等多種因素影響，本試驗土壤中毒死蜱殘留的半衰期與他人研究結果不同，但處于較低水平，可能與毒死蜱施用環境為強堿性、砂壤且農藥初始質量濃度較低等因素有關。

從降解機制上看，土著微生物和降解菌可將毒死蜱快速降解為中間產物3, 5, 6-三氯-2-吡啶酚（3,5, 6-trichloro-2-pyridinol，TCP），并最終代謝成為簡單的小分子化合物（?abar et al.，2016；John et al.，2015）。Dumas（1989）從缺陷短波單胞菌（B.diminuta）中提取獲得磷酸三酯酶，該酶可降解多種有機磷農藥。Gorla et al.（2009）利用分子生物學技術，證明該菌的有機磷水解酶定位于細胞內膜的周質一側，通過雙精氨酸轉運通路進行有機磷水解，故推測本試驗菌株——短波單胞菌 A1A18降解毒死蜱的機制可能與此有關。本試驗中未滅菌土毒死蜱殘留的降解率較滅菌土高出7.42%；施用降解菌A1A18的毒死蜱降解速率常數為0.170，半衰期縮減至4.09 d，降解率達88.81%。由此進一步證實微生物降解作用是土壤中毒死蜱殘留降解的重要途徑之一。

毒死蜱可以作為部分微生物的唯一碳源（Silambarasan et al.，2013；Deng et al.，2015），但是大部分微生物的降解作用屬于共代謝作用（Sethunathan et al.，1973；錢博等，2007），需要從毒死蜱外的其他物質中獲得能量。因此，人為添加外源營養物可以支持土著微生物和降解菌的增殖與活性需求。試驗結果證實，尿素或有機肥的添加對毒死蜱的降解具有一定促進作用，但外源降解菌的促進作用更強，使毒死蜱的降解速率常數由 0.082（對照）增至0.148（單施降解菌），說明該毒死蜱降解菌的功能特性較強，具有較好的田間應用潛力。

尿素、有機肥及二者配施可以促進土壤微生物的增殖與活性（Tejada et al.，2014；姬興杰等，2008），其中有機質對毒死蜱具有一定吸附作用（Singh et al.，2003）。本試驗土為砂壤，有機質含量低，尿素或有機肥的施用對土著微生物和降解菌的數量增加及其功能發揮都具有顯著促進作用。綜合表現為，在施用降解菌 A1A18時，與有機肥配施提高了農藥降解率，且效果優于無機肥。但是，兩種不同肥料混合配施與有機肥配施對毒死蜱降解過程的影響差異不顯著，說明兩種肥料對土壤毒死蜱降解的促進作用不具有疊加效應。另一方面，降解菌A1A18施用濃度與目標降解物的降解速率在一定范圍內具有相關性。可能是降解菌濃度過低，對農藥的整體降解效率也較低。反之，降解菌濃度過高，受土壤營養和目標降解物濃度的限制，農藥的整體降解效率也受到限制。因此，對土壤中殘留毒死蜱進行微生物修復需添加適宜濃度的降解菌。本試驗條件下，降解菌A1A18初始密度為6×107CFU·g-1時，與1%有機肥或與0.2%尿素+1%有機肥配施，毒死蜱的降解效率達到最高。

由上可知，在堿性砂壤中施用低濃度的毒死蜱，一方面砂質土壤結構、強堿性環境和土著微生物都有利于毒死蜱的降解，另一方面，適宜濃度的降解菌在外加碳源、氮源的促進下，較充分地發揮了毒死蜱降解作用。因此，在實驗環境中添加降解菌 A1A18并配施有機肥，對毒死蜱具有較好的降解效率。

在一般施藥水平下，隨著施藥后時間的延長，受抑制的微生物數量會逐漸恢復至正常水平（Shan et al.，2006；劉新等，2004；Pozo et al.，2010）。本研究中，毒死蜱施用初期，細菌數量出現不同程度的下降。降解菌不是試驗用土的土著細菌，一方面受堿性環境的影響，另一方面，施入土壤的降解菌濃度越高，細菌死亡的數量越多。至于毒死蜱對土壤細菌是否具有毒性，還有待進一步研究。試驗中真菌和放線菌數量顯著增加，其中真菌對毒死蜱的反應較快但增幅較小，放線菌的反應較慢但增幅較大，變化趨勢與已有研究結果相似（Chen et al.，2014；Dua et al.，2015）。究其原因，一方面由于真菌數量的下降，導致其他微生物獲得更多的生存空間；另一方面，放線菌和真菌的某些種類在堿性環境中對低濃度毒死蜱具有較好的抗性，在毒死蜱刺激下出現增殖現象，相關機制還有待進一步研究。隨著施藥后時間的延長，土壤中毒死蜱殘留量逐漸減少，各類微生物數量逐漸趨于正常水平。作物栽培和有機肥施用有利于土壤微生物多樣性，抑制土壤“真菌化”趨勢（Hartmann et al.，2015）。至施藥后第 21天，細菌和放線菌數量較絕對對照多，真菌數量呈降低趨勢。因此，當降解菌與肥料配施，總體表現為隨著施菌濃度的增加，毒死蜱殘留降解加速，有助于快速消除環境中毒死蜱殘留對土壤微生物的影響。

4 結論

（1）堿性土壤中毒死蜱的降解過程分為生物降解過程和非生物降解過程，其降解動態可采用一級動力學模型（Ct=C0·e-kt）進行模擬研究。

（2）不同濃度的降解菌和不同肥料施用，主要改變毒死蜱的降解速率，直接導致不同處理條件下毒死蜱半衰期發生變化，最終影響毒死蜱在土壤中的累積效應。

（3）短波單胞菌 A1A18對強堿性土壤中殘留毒死蜱的降解能力較好，可作為相關土壤修復劑的功能菌株。

（4）降解菌A1A18初始密度為6×107CFU·g-1時，與 1%有機肥配施或與 0.2%尿素+1%有機肥配施，可顯著促進堿性土壤中殘留毒死蜱的降解速率，快速消除毒死蜱對土壤微生物的影響，可作為毒死蜱污染土壤的微生物修復實施方案。