HPV分子生物學檢測方法研究進展

靳大川 梁彥玲 左雨點 路德榮 周 濤 郭寶強

人乳頭狀瘤病毒(human papillomaviruses， HPV)屬乳多空病毒科的雙鏈環狀DNA病毒，其基因組有大約8000個堿基對[1]。按照DNA序列差異分為5個屬，即α、β、γ、Mu、Nu，每個屬包括若干亞型。目前發現了200多種亞型，其中α屬65種[2]。對人類致病的HPV主要就是α屬。作為世界上最常見的性傳播病毒之一，HPV不僅是女性宮頸癌的元兇，也與肛管癌、陰莖癌、口咽部癌癥等有關[3,4]。國際癌癥研究機構(IARC)將α屬HPV亞型按致癌潛力分為高危亞型(high-risk HPV，HR-HPV)和低危亞型(low-risk HPV，LR-HPV)[5]。確認的HR-HPV有12種，即 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59亞型；另有13種可能致癌亞型，即26、30、34、53、66、67、68、69、70、73、82、85、97亞型[5]。市場上檢測HPV的試劑盒，絕大部分是針對α屬的HPV亞型[2]。其中，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準了5種用于原發性宮頸癌篩查的HPV檢測技術，即第2代雜交捕獲法(hybrid capture 2，HC2)、cervista HPV HR、cervista HPV 16/18、Cobas HPV檢測、APTIMA HPV檢測[1]。本文對常用的HPV分子生物學檢測方法綜述如下。

一、經典核酸雜交檢測方法

這類技術都屬于固相雜交技術，包括經典的Southern印跡、原位雜交、斑點印記雜交等，主要是采用放射性標記的同源性核酸探針，來檢測標本中的HPV感染。

1.Southern印跡雜交：方法特異性強，可以結合限制性片段多態性檢測(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)對HPV進行分型，但是敏感度差，操作步驟過于繁瑣，不適用于大規模標本檢測的情況。對所用DNA的產量(至少10μg)和質量要求都比較高，必須是新鮮或冷凍的臨床標本。因此對于石蠟固定的標本不太適用，因為這類標本的DNA分子往往已經發生了降解。

2.斑點印記雜交：操作比Southern印跡簡單，而且可以同時處理多個標本。其敏感度與Southern印跡結合RFLP相似，對標本的質量要求與Southern印跡相似，需要用新鮮或冷凍的標本，特異性也比較強。敏感度強于Southern印跡，需要DNA的量較少(0.5μg)，但是操作過程中有一定的放射性，因此也不太適合臨床廣泛開展。

3.原位雜交：其優點在于可以用于固定處理后的臨床標本，并且可以進行細胞定位。這種方法的特異性和Southern印跡相似。缺點是檢測的敏感度差，其敏感度低于斑點印記和Southern印跡法。另外，這種檢測手段對操作者的經驗要求較高，操作繁瑣，而且操作過程中容易出現探針的交聯，如果用于HPV的分型檢測，比較容易出現錯誤的結果。

總之，以上檢測由于操作較繁瑣，不太適用于處理大批量的臨床標本，且敏感度欠佳，目前主要用于實驗室研究，而在臨床上已經逐漸被其他方法所淘汰。

二、信號放大技術

1.第2代雜交捕獲法(HC2)：2003年獲得FDA批準，是第一種得到FDA批準的臨床HPV檢測方法。可用于新鮮宮頸細胞標本，也可用于甲醛溶液固定、石蠟包埋的組織[1]。該法檢測18種HPV亞型，包括13種HR HPV亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和5種LR HPV亞型(6、11、42、43、44)[1]。

其基本原理是將標記好的與不同亞型HPV DNA互補的混合RNA探針和變性的單鏈靶HPV-DNA雜交，再轉移至錨定了可以與特定的HPV-DNA和RNA雜交物相結合的捕獲抗體的微孔板上，洗脫背景后，通過抗體共軛結合堿性磷酸酶和化學發光底物，得到陽性檢測結果。

優點是標本處理簡單、操作簡便，重復性好，敏感度高(87%～96%)，最低可以檢出0.2～1.0pg/ml的HPV DNA，相當于1000～5000個拷貝的HPV DNA。可以判斷高危/低危亞型，也可以對病毒負荷進行半定量。缺點是費用較高；并且不能區分具體的HPV亞型；特異性相對較低(20%～85%)[1, 2]。由于交叉反應的問題，假陽性率約為10%～19%。另外沒有內對照。在很多國家，HC2被廣泛用于臨床作為標準化的HPV檢測方式。最近新一代的hybrid capture 3 (HC3)自動化檢測技術也已經出現，仍是檢測13種HR-HPV亞型,但降低了非特異性的檢測結果，減少了假陽性的發生。

2.cervista HPV HR檢測和cervista HPV 16/18檢測試劑盒：是FDA于2009年批準的臨床HPV檢測方法[1]。基本原理也是采用的信號放大技術檢測核酸序列，具體是通過其專利的兩個同步等溫反應和信號放大反應檢測特定的核酸序列，同時檢測人組蛋白2基因作為內對照，從而更好地消除假陰性的結果。

cervsita HPV HR試劑盒檢測14種HR HPV(在HC2檢測的13種亞型基礎上增加了HPV66)。初始版本的cervista試劑盒有很多需要手工操作的步驟，不適用于大批量標本的檢測。2009年11月后出現了全自動操作版本，敏感度和特異性與HC2檢測相當。在CIN Ⅱ和CIN Ⅲ標本中，敏感度分別高達98%和100%[15]。這種試劑盒設計的目的是用來快速區分高危和低危亞型HPV感染，但不區分具體是哪一種或者哪幾種亞型的感染。cervista HPV 16/18試劑盒采用的同樣的檢測技術，但可以并只能區分HPV16/18亞型。這是FDA批準的第一種HPV基因分型檢測方法，相比cervista HPV HR試劑盒有更好的敏感度，更低的假陽性率。通常作為一種隨訪檢查手段和cervsita HPV HR配合應用[1]。

三、核酸擴增及衍生技術

1.普通聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)：一般認為，PCR技術有高敏感度、高特異性的特點，簡便快速，臨床應用廣泛[6]。如果選擇針對HPV基因組保守序列的引物，比如L1區序列，可以同時擴增多種HPV。然后進一步采用RFLP、線性探針檢測或者直接測序等手段進一步區分亞型。也可以開始就采用亞型特異性的引物進行PCR反應，可以免去第二步分型的步驟。

PCR的缺點：如果有多種亞型感染，不同亞型的HPV DNA在擴增反應時，會出現引物競爭，這樣含量較少的HPV亞型就可能競爭失敗，出現假陰性的檢測結果。因為存在這個問題，PCR可能無法檢測出標本中所有的被感染的HPV亞型。進一步測序需進行亞型分析，操作較繁瑣。如果直接用亞型特異性引物，可省掉進一步分型的步驟，但需要對目標亞型一一檢測。PCR檢測可以用于新鮮標本，也可以用于石蠟包埋的標本，但是甲醛溶液固定會導致DNA降解，影響檢測的準確性。

2.巢式PCR: 是用第一輪PCR的產物為底物模板，進行第二輪PCR。這種PCR比傳統PCR的敏感度顯著提高，并且節省標本；但是另一方面，操作也比較繁瑣，需要更多的試劑，也更昂貴。主要缺點是標本間容易出現交叉污染，從而大大降低其臨床應用的價值[1]。

3.聚合酶鏈反應-限制性酶切片段多態性(polymerase chain reaction -restricted fragment length polymorphisms，PCR-RFLP): 是將PCR擴增產物用限制性內切酶消化成為若干大小不一的片段，然后電泳并對照參照物區分亞型。常用的內切酶包括PstⅠ、HaeⅢ、DdeⅠ和RsaⅠ，可區分17種HR-HPV和11種LR-HPV[7]。這種方法和基因芯片檢測比較，敏感度稍差，可用作HPV初篩檢測。但對HPV多重亞型感染的檢出不理想，檢出率只有25%(20/80)。操作比測序容易，也更經濟，不需要復雜的設備，因此適合資源欠缺地區對HPV進行分型檢測。

4.反向線性點雜交技術(reverse line-blot assay，RLB)：這種技術是把寡核苷酸探針固定在固相尼龍膜上，PCR產物加入液相，以檢測有信號的產物。其優勢在于可快速進行亞型分型檢測。并在檢測HPV陽性標本時，與HC2法有很高的一致性。缺點是比較耗時、操作繁瑣[8]。甲醛溶液固定的標本往往出現DNA的降解，會影響檢測，不宜直接用RLB法檢測[8]。

5.線陣檢測法(linear array，LA)：是Roche公司將廣譜PCR和反向線點雜交技術結合，發明的一種新的HPV分型檢測技術。可以檢測36種高危和低危HPV亞型。缺點是溫育步驟比較繁瑣、耗時。2006年Matthew等對這種方法進行了改良，用干風溫育代替了水浴，而檢測結果的敏感度和特異性都不受影響。但由于交叉非特異性雜交的存在，線陣分析的假陽性率高于PCR檢測方法。

6.APTIMA HPV檢測技術：是FDA于2011年批準的一種基于轉錄介導的擴增和探針雜交的HPV檢測，包括3個步驟： 靶基因捕獲、轉錄介導的擴增、雜交保護檢測擴增的產物[1]。它有自帶的內對照，通過高度自動化的步驟同時檢測14種高危亞型的E6/E7 mRNA，是比較少見的不以HPV的L1區為靶標、不直接檢測HPV DNA的檢測方法。它只得到一個HR-HPV合并陽性或者陰性的結果，不能區分亞型[9，10]。其敏感度與HC2以及后文提到的cobas HPV檢測相似，但特異性更好[1，9，11]。HR-HPV引起細胞惡性轉化主要通過E6/E7區基因，以其為靶區也提高了篩查HR-HPV的特異性和敏感度。

7.實時熒光定量PCR及衍生技術：這類方法不但能檢出具體的HPV亞型，而且可以對病毒負載量進行檢測。優點是敏感、快速、可靠，特異性也很好。與HC2檢測有很高的一致性(91.4%～98.0%)[12]。如果采用不同熒光，可以同時檢測不同的HPV亞型。此類方法例如美國FDA于2011年批準的cobas 4800 HPV檢測，就是一種高度自動化的實時熒光定量PCR檢測[1]。cobas檢測以HPV的L1區為靶區，以β球蛋白基因作為內對照。此類方法的優勢在于檢測成本低，用時也比較短，僅需約2.5h[13]。由于不同HPV高危亞型的致癌潛力不同，因此HPV分型檢測技術得到越來越多的關注。cobas HPV可以檢測14種HR-HPV，并對16 和18亞型可以進行特異性的基因分型。

基于實時熒光定量PCR技術的HPV檢測方法還有很多，例如Anyplex Ⅱ HPV28檢測試劑盒可以檢測19種HR-HPV和9種LR-HPV[12]。AdvanSure HPV GenoBlot 檢測方法是近年來發展的另一種熒光定量PCR技術[14]。它采用單管巢式非對稱實時PCR，通過擴增HPV L1區和反向雜交，后續采用AdvanSure GenoLine Station系統自動分析PCR陽性的標本，可以同時檢測20種高危HPV亞型(16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、69、70、73和82)和15種低危HPV亞型(6、11、32、34、40、42、43、44、54、55、57、61、62、81和83)。這種方法和HC2的檢測一致性高達98.5%，并且有更高的特異性[14]。

8.基因芯片技術：是將PCR產物和基因芯片雜交，經過洗脫步驟后，雜交的信號用專用的芯片掃描儀讀出，常用ADAT1基因作為內對照[15]。該法比普通的凝膠電泳檢測方法的敏感度和特異性更高，敏感度接近100%，特異性達到97.4%。可以分型檢測，也適合大量標本平行分析。與HC2相比，在檢測宮頸上皮內瘤變2級的標本時，敏感度和特異性相似，并在HPV陽性標本檢測上有很高的一致性[16]。缺點是必須先進行PCR擴增，芯片比較昂貴，檢測需要商業化的基因芯片掃描儀，檢測成本較高[16]。

9.下一代測序技術(next-generation sequencing, NGS)：和一般測序不同，NGS可以在短時間內進行平行大批量測序，提供很多其他檢測方法不能提供的信息，不僅包括病毒亞型、負荷量，還可以檢測細胞染色體DNA水平的損害，例如HPV DNA的整合、插入位點等，但是檢測試劑比較昂貴，設備比較復雜，對操作人員的知識水平要求也比較高[17,18]。近年來Helicos Biosciences公司開發的基于Illumina平臺的NGS與其他平臺相比，大大降低了費用，并且檢測效率大大提高，目前已經得到了很多臨床實驗室的認可[1,19,20]。

10.Xpert HPV檢測: 是近年來開發的一種新的實時定量PCR檢測方法。其擴增和檢測同時進行，采用全自動工作流程，并且反應體系完全內部質控，無需外部對照。可以對14種HR-HPV亞型分型檢測，并可以提供病毒負荷量信息[21]。除了新鮮細胞學標本，也可用于甲醛溶液固定的標本[22]。與HC2比較，其敏感度稍強而特異性稍差，二者檢測結果有非常好的一致性。并且此種方法成本低、操作更為迅速，一般1h左右即可，便于大批量處理標本，也可以隨時進行任意檢測而無需批次檢測[22]。雖然目前還沒有得到FDA的認定，但是很多研究者認為這是將來很有前景的一種HPV檢測技術[21,23]。

四、生物化學檢測方法

1.質譜分析法 (mass spectrometry)：可在短時間內檢測大批量的臨床標本，是一種快速、可靠、經濟的檢測方法[24]。其快捷程度可以與基因芯片檢測方法相比。敏感度和特異性均優于HC2,并且可以用于甲醛溶液固定、石蠟包埋的組織標本的檢測，可以檢測各種高危和低危亞型HPV。既可以檢測L1區，也可以檢測E6/E7區。

2.基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/Ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS): 是最近出現的一種軟電離質譜檢測技術，通過檢測HPV的蛋白質指紋圖譜，并與質譜圖庫對比，做出快速的檢測。它同時檢測14種HR-HPV, 比PCR基因測序檢測更敏感，易于大批量自動化檢測，并且快速、經濟、準確，適合HPV的初篩。

3.表面等離子共振技術(surface plasmon resonance, SPR): 其原理是物質間的相互作用導致芯片表面質量變化，從而對HPV進行分型檢測。優勢在于快速、免標記、高通量、高靈敏，并可進行定量和亞型分析。它可以檢測16種HR-HPV和8種LR-HPV。研究表明其敏感度與HC2相似，而且特異性更高(53.33% vs 33.33%)。

五、展 望

HPV是公認的4種致癌微生物之一，也是IARC認定的11個一類致癌生物因子之一。對其感染進行早期和正確的診斷，無疑對于宮頸癌及其他HPV相關惡性腫瘤的預防及診治有重要的臨床意義和社會價值[25]。由于HPV不能培養，準確的診斷完全取決于適當的分子生物學檢測技術。目前市場上的HPV檢測藥盒有數百種之多，采用不同的檢測方法，有不同的檢測敏感度、特異性和標本及臨床適用性。根據具體的檢測目的、要求、標本狀況等因素選擇適當的HPV檢測技術是得到滿意結果的保證。要得到一個同時具有高敏感度和高特異性的檢查方法，理論上來說是互相矛盾的。每種HPV檢測方法都有其優勢和不足，總有一種或幾種合適的選擇。通過了解不同的檢測手段，根據不同的檢測要求，合理的權衡比較，選擇正確的檢測方法，一定會得到有效、經濟、理想的結果。