低氧誘導因子-1在結直腸癌中的研究進展

徐 君 朱陵君 張 倩

結直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，每年新確診病例有136萬，大約70萬死于結直腸癌，其發生率和病死率位居世界第3位和第4位[1]。在過去的幾十年中，隨著診療技術的發展和靶向藥物的出現，很多國家的結直腸癌生存率都有所提高，尤其是在一些高收入國家，如在美國、澳大利亞、加拿大及一些歐洲國家的結直腸癌5年生存率已經達到了65%以上，但在一些低收入國家尚未達到50%，嚴重威脅著人類的生命健康[2, 3]。

缺氧是實體腫瘤生長的普遍微環境[4]。腫瘤組織迅速生長、腫瘤內部血流灌注不足及腫瘤患者的身體狀態的改變是造成腫瘤缺氧的主要原因，缺氧在腫瘤血管生成、腫瘤細胞侵襲轉移和腫瘤細胞的代謝等多個生物學行為中起重要作用，缺氧的適應是導致腫瘤進展、治療敏感度下降、不良臨床預后的主要驅動力，嚴重的缺氧可激活腫瘤生長因子, 造成腫瘤對化學治療和放射治療的耐受，可作為總生存時間和無病生存期的預測因子[5]。腫瘤細胞為適應缺氧微環境，通過激活腫瘤細胞內的一系列調控因子進而改變腫瘤的生物學行為，而低氧誘導因子(hypoxia inducing factor，HIF)是腫瘤細胞應對低氧狀態的最主要調控分子，分別包括HIF-1、HIF-2及HIF-3 3個成員，其中HIF-1表達最為廣泛。近幾年研究證明低氧誘導因子-1與結直腸癌的發生、發展、侵襲轉移及預后密切相關。本文就HIF-1的生物學特征及其在結直腸癌中的研究進展做一綜述。

一、HIF-1結構

HIF-1是腫瘤細胞應對低氧狀態的一種轉錄因子，是由α亞基和β亞基組成的異源二聚體，HIF-1α亞基為細胞內氧含量調控的功能性亞基，僅在缺氧細胞的核內存在，β亞基為細胞內穩定表達結構性亞基并起著結構性作用，在正常細胞和缺氧細胞中均有組成性表達。在缺氧條件下，HIF-1α可與HIF-1β亞基聚合形成異二聚體調節多種基因的轉錄，通過促進血管生成、細胞增殖、侵襲轉移等途徑促進腫瘤的發展[6]。

二、HIF-1表達水平的調控

在常氧條件下，HIF-1α上的脯氨酸殘基被脯氨羥基化酶 (prolyl hydroxylase domain，PHD) 羥基化后與希佩爾-林道蛋白(product of von hippel-lindau gene，pVHL)結合，隨后被泛素-蛋白酶水解復合體降解，因而細胞中基本檢測不到HIF-1α亞基的表達。PHDs是在哺乳動物中發現的HIF脯基羥化酶，包括PHD1、PHD2、PHD3 3種亞型，作為調節HIF-1α的氧氣傳感器參與HIF-1α的降解過程，脯氨羥基化酶的活性除了受氧水平的調控，鐵、2-酮戊二酸和抗壞血酸也參與其調控，其中PHD2作為主要的限速酶使HIF-1α在缺氧環境中保持穩定的低水平狀態，其活性主要受細胞內氧濃度控制[7]。在缺氧條件下，PHD 的活性被抑制，pVHL無法與HIF-1α的脯氨酸殘基結合，HIF-1α的泛素化和降解被抑制，在細胞核內與HIF-1β亞基聚合形成異二聚體調節多種靶基因的轉錄。除了pVHL途徑，一些信號蛋白如SUMO-1、RSUME、RACK1、Hsp90也調節HIF-1α的表達水平[8]。

三、HIF-1轉錄活性的調控

在缺氧條件下，HIF-1α可以逃避泛素連接酶E3的特異性識別，從細胞質轉移到細胞核，HIF-1α的核質穿梭通過經典的核運輸受體輸入蛋白α/β調節其轉錄活性，輸入蛋白α/β直接與HIF-1α的C-末端區核定位信號(NLS)相互作用，相反的，N-末端區核定位信號并無此作用[9]。在有絲分裂原活化蛋白激酶的作用(MAPK)途徑中HIF-1α可以直接被磷酸化，在細胞核內聚集，自由的與HIF-1β亞基聚合形成異二聚體，HIF-1的C-TAD與轉錄輔因子P300/CBP相互作用，與靶基因啟動區內的缺氧反應元件(HERs)結合，促進HIF-1α的轉錄活性。在常氧環境下，HIF-1內的Asn803殘基被HIF-1抑制因子天冬酰胺羥化酶(FIH-1)羥化，阻斷HIF-1與P300/CBP結合，導致HIF-1介導的基因轉錄停止，而在缺氧條件下，HIF-1的活性直接被抑制，使HIF-1與P300/CBP相結合啟動靶基因的轉錄。由此可知，調節HIF-1的活性主要包括兩條氧依賴的羥基化途徑：脯氨酸羥基化途徑和天冬酰胺羥基化途徑，體外實驗研究證明脯氨酸羥基化途徑調控HIF-1蛋白比天冬酰胺羥基化更敏感[10]。

四、HIF-1對靶基因的調控

HIF-1通過調節多種靶基因的轉錄參與腫瘤的發生、發展，包括腫瘤血管的生成、葡萄糖的代謝、細胞增殖侵襲和細胞的凋亡等過程[11]。新生血管的生成是腫瘤生長、侵襲和轉移的必要條件，缺氧條件下，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是HIF-1調節腫瘤血管生成的重要靶基因。缺氧環境使HIF-1α與VEGF的啟動子區域相結合, 增強VEGF對缺氧的反應性并激活VEGF的表達，進而促進新生血管內皮細胞增殖遷移和滲透[12]。HIF-1介導的血管生成是一個復雜的過程，VEGF是調節腫瘤血管生成的一個關鍵因子，其他的一些細胞因子如一氧化氮合酶(NOS)、內皮素-1(ET-1)、基質細胞衍生因子-1(SDF-1)、血管生成素2(ANGPT2)、血小板衍生的生長因子(PDGF)和瘦素等在腫瘤血管生成中也扮演著重要角色[13]。最近的研究開始關注在缺氧微環境中腫瘤能量代謝的改變，其中轉錄因子對糖代謝基因的調控是腫瘤能量代謝的重要機制，在缺氧微環境中，腫瘤細胞通過高速率的糖酵解為快速增殖的腫瘤細胞供給能力，增加腫瘤的惡性潛能[14]。HIF-1是促進糖酵解的主要轉錄因子，HIF-1可激活糖酵解途徑中各種酶(GLUT1、HK、LDHA)的表達，使腫瘤細胞在缺氧環境中通過無氧糖酵解促進葡萄糖糖轉化成乳酸，滿足腫瘤細胞的能量需要[15]。缺氧可誘導生長因子如胰島素樣生長因子-2(IGF-2)、轉化生長因子(TGF)、 C-MYC 和分化抑制劑-2(ID2)等基因的表達促進腫瘤細胞的增殖，也可通過上調P53、BNIP3、caspase-3等基因的表達誘導腫瘤細胞凋亡，所以HIF-1對缺氧環境中的腫瘤細胞的調節具有雙重作用。HIF-1α主要通過調節腫瘤細胞相關轉移因子包括基質金屬蛋白酶2 (MMP2)、纖維連接蛋白1(FN1)、自分泌運動因子(AMF)、C-MET和角蛋白14(KRT14)等基因的轉錄及表達介導腫瘤侵襲和轉移[16]。

五、HIF-1與結直腸癌的發生、發展及治療

1.HIF-1與結直腸癌的發生、發展：很多研究證明HIF-1通過直接或間接調節結直腸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲轉移、血管生成等生物學行為促進腫瘤的發生、發展。細胞暴露于缺氧環境下導致蛋白合成減少進而限制了細胞凋亡和擴散，持續的缺氧會改變細胞的周期和相對靜止期的細胞數量，而HIF-1α激活細胞周期依賴抑制因子P27Kip1和P21Cip1導致細胞周期阻滯在G1、S期[17]。在正常和腫瘤組織中，缺氧微環境都可以誘導細胞的凋亡，在缺氧環境下P53水平升高可激活凋亡的下游感受器APAF1 和caspase-9，缺氧也可以激活P53相關的凋亡通路，包括Bcl-2家族的相關基因，導致細胞的死亡[18]。缺氧使基因發生突變進而影響基因的穩定性，通過促進腫瘤干細胞的穩定和演變從而調控細胞的分化，長時間的遺傳和遺傳表型的改變賦予腫瘤細胞自我更新的能力進而發展成惡性腫瘤細胞[19]。

賴氨酰氧化酶(LOX)控制腫瘤細胞的轉移性生長和播散，是HIF-1促進腫瘤進展的關鍵基因，HIF-1α可與LOX啟動子中低氧反應元件的結合，從而上調LOX的表達，同時，有研究表明LOX可正向調節HIF-1α的表達，是缺氧后上調HIF-1α表達的關鍵成分[20]。根據這一研究結果，筆者可以推測同時以LOX和低氧誘導因子為靶點的靶向藥物可改善腫瘤治療效果。Zheng等[21]的體內外研究證明HIF-1通過誘導下調同源結構域蛋白CDX2的表達水平促進結直腸癌的惡性進展，與結直腸癌的組織分化、病理分期及淋巴結轉移有關，而且發現Snail也參與HIF-1誘導的CDX2表達衰減這一過程，說明在結直腸腺癌中，缺氧通過Snail滅活CDX2的表達進而促進腫瘤的發展，但是Snail是如何調節 CDX2的具體調節機制尚不明確，需要開展更多的研究進一步闡明，未來HIF-1α-Snail-CDX2通路可能成為結直腸癌靶向治療的新靶點。內皮細胞特異分子-1(endocan，ESM-1)是結直腸癌的潛在血清標志物，KIM等發現在結直腸癌組織患者中，ESM-1的表達水平受HIF-1α的調節，通過免疫組織化學實驗發現ESM-1的表達水平與結直腸癌的腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結狀態、遠處轉移和Dukes分期相關，影響著結直腸癌的復發和生存時間，是結直腸癌患者的一個獨立預后因素[22]。15-脂加氧酶1(15-LOX-1)表達于人的多種組織細胞中，是催化不飽和脂肪酸代謝的關鍵酶之一，在結直腸癌和很多腫瘤中其表達水平下降，作為抑癌基因抑制多種腫瘤的形成，但是關于其在腫瘤轉移中的作用研究結果并不一致，Wu等[23]發現在結腸癌細胞株中，過表達15-LOX-1可以抑制結腸癌細胞生長、血管內皮生長因子(VEGF)的表達、腫瘤血管生成、腫瘤細胞遷移和侵襲等生物學過程，在缺氧條件可通過降低HIF-1α的穩定性，促進其凋亡從而降低HIF-1α的表達，說明15-LOX-1可以通過HIF-1α抑制缺氧誘導的腫瘤轉移，該研究表明15-LOX-1不僅可以作為結直腸癌靶向治療的新靶點，還可作為結直腸癌遠處轉移的標志物。但也有研究表明在腸癌細胞中過表達15-LOX-1可抑制細胞的遷移、侵襲及轉移，需要更多的研究進行探討[24]。

2.HIF-1與結直腸癌的治療：很多研究已經證明HIF-1的激活在結直腸癌發生、發展起到關鍵作用，因此阻斷HIF途徑及抑制HIF-1表達為結直腸癌的治療新策略。研究發現許多藥物通過抑制mRNA的轉錄、下調蛋白質的合成、干擾HIF-1穩定性、抑制亞基的聚合、干擾HIF-1-DNA的結合、減弱HIF-1的轉錄活性等機制直接或間接抑制HIF-1的活性或表達，進而來治療結直腸癌[25]。Kizaka等[26]在體內研究中發現，控制腫瘤中HIF的活性或阻斷HIF的通路，腫瘤的生長受到顯著的抑制，同時可增加腫瘤對化療藥物的敏感度。在小鼠神經母細胞異種移植瘤模型中的研究發現，通過低劑量的拓撲替康抑制HIF-1α的轉錄活性，可以明顯增強貝伐珠單抗的抗血管生成治療效果[27]。Kyunghee等發現，在結腸癌細胞株中，抑制HIF-1和HIF-2的表達都可以提高舒尼替尼的治療效果，在小鼠異種移植瘤模型中，HIF-1α和HIF-2α的表達被抑制后，50%的小鼠獲得完全緩解。

缺氧微環境在促進抗癌藥物產生耐藥性方面起著關鍵作用，低氧誘導因子-1(HIF-1)是腫瘤治療過程中產生多重耐藥基因(MDR1)的一種生物標志物，可促進P-糖蛋白的表達，P-糖蛋白是與化學治療(以下簡稱化療)耐藥密切相關的一種跨膜蛋白。研究發現缺氧使很多腫瘤細胞在增殖過程中停滯于G1期，繼而對化療藥物的敏感度降低，其機制可能為缺氧環境下腫瘤細胞內拓撲異構酶Ⅱ的表達被抑制，腫瘤細胞會對以拓撲異構酶代謝為機制的化療藥物產生耐藥性。HIF-1通過調節代謝過程中的一些關鍵酶參與腫瘤細胞耐藥性的產生，前期研究發現體內的乳酸含量與腫瘤患者的預后負相關，這表明從線粒體氧化呼吸到細胞糖酵解的關鍵酶可增加化療藥物的耐藥性[28]。丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)是糖酵解和氧化磷酸化的關鍵酶，在腫瘤細胞的增殖、侵襲轉移及凋亡等過程中發揮著重要的作用，與腫瘤患者的化療耐藥性的產生密切相關，研究表明PDK3的表達受HIF-1的調控，在缺氧條件下HIF-1的表達上升，繼而上調PDK的表達，與缺氧誘導的耐藥性增加相關，可以解釋高表達PDK3的患者化療失敗的原因。HIF-1對PDK3的調控作用提示可以通過抑制HIF-1下調PDK3的表達，自上游抑制PDK3的表達，從而減少缺氧而產生的耐藥性。

貝伐單抗是NCCN指南推薦的用于晚期結直腸癌的抗血管生成靶向藥物，聯合FOLFOX、FOLFIRI方案可取得良好效果，貝伐單抗主要與內源性VEGF-A競爭性結合其受體，阻斷其活性從而抑制下游血管生成過程，進而發揮抗腫瘤作用。有研究顯示VEGF是HIF-1α的下游靶基因，在缺氧情況下上調的HIF-1α誘導VEGF基因的表達，促進血管的形成，進而促進腫瘤細胞的生長及轉移。此種關系為將來研究針對HIF-1α的靶向藥物提供理論基礎。

3.HIF-1與結直腸癌的預后：在過去的幾十年，隨著診療技術的發展和靶向藥物的出現，結直腸癌的生存率有了一定的提高，但是發生轉移的晚期結直腸癌患者的預后仍然很差。很多研究發現HIF-1的異常表達與結直腸癌的發展、預后密切相關。一項包含731例結腸癌患者的病例對照研究發現，HIF-1的表達水平與結直腸癌的病死率密切相關，說明HIF-1是結直腸癌的獨立預后因子。Mariko等發現HIF-1的表達水平影響術前行新輔助化療的局部晚期直腸癌患者的總生存率及無復發生存率，HIF-1表達陽性和陰性的直腸癌患者的3年無復發生存率分別為47.6%和82.8%，3年總生存率分別為60.6%和85.2%，差異有統計學意義。在肝轉移的結直腸癌患者中，肝轉移灶中HIF-1α和VEGF的表達水平都明顯高于原發灶，HIF-1α的過表達是結腸癌肝轉移術后復發的獨立預后因子，說明HIF-1α是結直腸癌肝轉移患者的潛在治療靶點。Kevin等認為P21蛋白活化激酶(PAK1)通過上調HIF-1α的表達間接影響結直腸癌的生存時間。以上研究證明，高水平的HIF-1是結直腸癌患者的不良預后因子，HIF-1可作為預測結直腸癌患者預后的新型生物標志物。

六、展 望

總的來說，HIF-1在結直腸癌的細胞增殖、侵襲轉移、血管生成、放療、化療耐受性及預后方面起著重要作用，為早期診斷和預后判斷提供了新的依據，也為結直腸癌的治療提供了一種新的靶點。HIF-1通路中的一些小分子抑制劑可以抑制腫瘤的形成，而且與其他治療方式聯合可以提高腫瘤的治療效果，但是這些小分子抑制劑具有一定的局限性，比如不良反應，特異性相對較低，抗腫瘤效果不明顯以及缺乏臨床療效評估。因此，深入探索如何阻斷HIF信號通路，開發以HIF為靶點的抗腫瘤藥物，確定對HIF抑制劑敏感的細胞類型尋找新的治療策略、提高癌癥治療效果至關重要。