Wnt/β-catenin信號通路抑制劑對骨肉瘤生長作用的研究進展

謝曉亮 李玉梅 朱海霞 樊天佑

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是兒童和青少年長骨干骺端常見的原發性惡性骨腫瘤，以產生骨樣基質為病理特征，具有高復發率、多藥耐藥性、早期易肺轉移等特點[1]。以往骨肉瘤患者采用患肢手術切除治療為主，隨著以甲氨蝶呤、順鉑等為基礎的新輔助化學治療(以下簡稱化療)的應用，骨肉瘤患者的5年生存率提高到60%～70%，但卻不能有效地降低總病死率和改善整體預后，出現轉移或復發的患者5年生存率<20%[2, 3]。Wnt/β-catenin信號通路已被證實在多種腫瘤的發生和發展中起著重要的作用[4,5]。眾多研究表明，Wnt信號的異常激活和β-catenin的高表達與骨肉瘤異常組織學形態及細胞的異常增殖和分化相關，最終導致骨肉瘤的發生[6～8]。同時在骨肉瘤細胞系中Wnt/β-catenin信號的多種配體、受體以及共同受體均呈高表達，而Wnt信號抑制因子WIF-1、DKKs水平卻處于低表達狀態，表明Wnt/β-catenin信號在骨肉瘤細胞中的異常激活是導致骨肉瘤發生和發展的一個重要因素[9]。因此，通過靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性可能成為骨肉瘤治療的一個新策略，尋找Wnt/β-catenin信號通路抑制劑成為探索治療骨肉瘤的新熱點。

一、Wnt/β-catenin信號通路的組成及機制

Wnt信號通路在胚胎發育中扮演重要角色，對控制骨骼發育、骨量和成骨細胞分化起關鍵作用。Wnt信號通路由細胞膜(包括膜外和膜上)、細胞質和細胞核3部分信號組成，即細胞膜外Wnt蛋白，細胞膜上特異性7次跨膜受體卷曲蛋白(Frizzled)和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)，胞質內的散亂蛋白(Dvl)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、軸蛋白(Axin)、結直腸腺瘤性息肉蛋白(APC)、酪蛋白激酶Ⅰ(CK1)、β-連環蛋白(β-catenin)，細胞核內轉錄因子T細胞因子(TCF)/淋巴樣增強因子(LEF)家族及其下游靶基因，如MMPs、survivin、cyclin D和c-Myc等組成，由于經典Wnt通路的啟動依賴β-catenin轉入細胞核，故稱為Wnt/β-catenin信號[10, 11]。

在沒有Wnt配體存在時，胞質內大部分β-catenin與細胞膜上E-鈣黏蛋白結合，使之附著于細胞骨架蛋白肌動蛋白上介導細胞之間黏附。對于少部分游離型β-catenin則被Axin、APC、CK1和GSK-3β形成的β-catenin降解復合物通過氨基端磷酸化及U3泛素連接酶β-轉導素重復蛋白(β-TRCP)識別泛素化，最終通過泛素蛋白酶體途徑降解。因此細胞內游離的β-catenin水平低，不能轉入細胞核內啟動轉錄因子TCF/LEF的轉錄作用而阻止下游靶基因的表達[12]。反之，當細胞受到Wnt信號刺激時，胞膜外配體Wnt蛋白分子同時與7次跨膜細胞的特異性受體Frezded和輔助性受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)結合，促進胞質內Dvl蛋白的活化，活化的Dvl蛋白抑制β-catenin降解復合物中關鍵成分GSK-3β的活性，使β-catenin不被GSK-3β磷酸化，避免了泛素蛋白酶體對其識別和降解而積聚在細胞質中。當β-catenin在細胞質中積聚到一定濃度時就開始轉向細胞核內，并與細胞核內轉錄因子TCF/LEF結合導致下游靶基因的啟動因子暴露而被激活表達，引起細胞的異常增殖，凋亡抵抗等作用，促進腫瘤的形成[9]。因此，β-catenin被認為是整條信號通路中的關鍵樞紐分子，它由細胞質向細胞核的轉移被認為是該信號通路激活后行使其功能的重要特征[13]。

二、Wnt/β-catenin信號通路抑制劑與骨肉瘤

骨肉瘤是一種高度惡性的侵襲性疾病，雖然隨著根治性手術結合新輔助化療的應用，患者的5年生存率有了較大的提高，但它仍然是醫學上難以攻克的難題。以往研究表明Wnt/β-catenin信號通路的異常激活參與了骨肉瘤的發生、發展，但其機制較為復雜，通過抑制該信號通路的活性可抑制骨肉瘤發生、發展[14]。目前通過抑制Wnt/β-catenin信號通路阻礙骨肉瘤的發展主要圍繞在藥物類抑制劑、酶類抑制劑、微小RNA等抑制作用的研究。

1.藥物類抑制劑：耐藥性是骨肉瘤患者治療失敗的歸因之一，尤其是多藥耐受性，尋找藥物作用新靶點是解決骨肉瘤藥物耐受的關鍵。盡管如此，對于骨肉瘤患者來說，藥物耐受的關鍵機制仍然沒有定論。

(1)GSK-3β藥物作用靶點：GSK-3β可使β-catenin 磷酸化，磷酸化位點為β-catenin的4個N端位點，這些位點為β-catenin磷酸化的一個標志，將被蛋白酶體降解，是Wnt/β-catenin信號通路的負調控因子[15]。近年來， Liu等[16]研究發現青蒿素能夠抑制骨肉瘤細胞和裸鼠移植瘤的生長，其機制是通過抑制GSK-3β中絲氨酸9(Ser9)磷酸化來激活GSK-3β降解β-catenin；同時青蒿素能下調骨肉瘤細胞中的Dvl蛋白，解除了Dvl蛋白對由GSK-3β、APC和Axin等形成的降解復合體中的關鍵成分GSK-3β活性的抑制，使β-catenin被GSK-3β磷酸化所降解，使Wnt/β-catenin信號轉導失活抑制骨肉瘤的活性。同時也有研究表明冬凌草甲素通過增加GSK3β的活性和上調dickkopf-1(Dkk-1)表達，下調了β-catenin的表達抑制143B細胞的增殖作用，相反，Dkk-1過表達或β-catenin敲低可以增強143B細胞中冬凌草甲素對細胞的增殖抑制作用[17]。Chang等[18]研究表明重樓皂苷(PPI)具有抑制骨肉瘤的生長、侵襲轉移作用，其機制與Wnt/β-catenin信號通路的失活有關，PPI能靶向降低p-GSK-3β的表達，導致活性β-catenin水平下調，使通路被抑制，而加入GSK-3β特異性抑制劑CHIR99021后，PPI誘導的骨肉瘤細胞活力抑制被消除，表明通過抑制該通路具有很好的抑瘤效果。綜上研究可見多種藥物可通過增加GSK-3β的活性，促進β-catenin的降解并減少其向細胞核內轉移，使Wnt/β-catenin信號通路失活，抑制腫瘤的生長。靶向作用GSK3β使Wnt/β-catenin信號通路失活可能是骨肉瘤的潛在治療靶點。

(2)β-catenin藥物作用靶點：Ma等[19]體外實驗研究表明夾竹桃苷能抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲，促進細胞的凋亡，具有很好的抗癌作用，其作用機制是通過減少骨肉瘤細胞質總β-catenin的表達以及減少β-catenin向細胞核內轉入，抑制了Wnt/β-catenin信號通路轉導。同時Wnt特異性TOP/FOP熒光酶素報告基因表達量的減少也表明減弱了轉錄因子TCF/LEF在Wnt/β-catenin信號通路中的轉錄活性，以及下調Wnt靶基因MMP2和MMP9的表達抑制細胞的遷移侵襲能力。Guo等[20]研究表明黃芩素處理的骨肉瘤細胞中β-catenin及其靶基因(包括C-myc，cyclin D1和survivin)的水平顯著下降，而β-catenin的外源性過表達可逆轉黃芩素的抗增殖和抗轉移作用。在異種移植瘤模型，發現黃芩素的治療顯著抑制移植瘤的生長，提高荷瘤鼠的生存率，抑制瘤體β-catenin的表達。Tie等[21]研究表明淫羊藿苷通過下調Wnt/β-catenin信號通路能誘導骨肉瘤細胞的凋亡及抑制細胞的生長，減弱TOPFlash熒光表達，腺病毒過表達β-catenin后能逆轉淫羊藿苷的抑制作用。Liu等[22]研究表明芹菜素可抑制人骨肉瘤細胞增殖，減少其侵襲能力，下調β-catenin的表達抑制骨肉瘤的生長。當β-catenin過表達時抑制作用減弱，敲減β-catenin的表達時抑制作用增強，表明芹菜素通過作用該通路抑制骨肉瘤細胞的生長。同時另有研究表明白藜蘆醇、烏索酸等也具有通過下調β-catenin的表達抑制Wnt/β-catenin信號的活性而使骨肉瘤細胞的生長被抑制[23，24]。

以上研究表明，不同藥物具有不同的作用靶點，其中β-catenin的下調對通路的活性抑制具有重要的作用，通過抑制通路的不同環節使異常激活的Wnt/β-catenin信號通路被抑制將是骨肉瘤治療的重要策略之一。

2.酶類抑制劑:Xia等[25]研究表明環氧化酶COX-2塞來昔布通過激活GSK-3β依賴性基因的轉錄使β-catenin被磷酸化而降解，減少β-catenin向細胞核轉入而使Wnt/β-catenin信號通路失活，抑制MG-63細胞生長。Li等[26]研究表明TIKI2是抑制Wnt信號的蛋白酶，在骨肉瘤標本和細胞系中TIKI2低表達，TIKI2蛋白酶能抑制Wnt/β-catenin信號通路的活性，能將成熟的Wnt蛋白去除N-末端氨基酸，Wnt蛋白隨后被寡聚化而失活。通過腺病毒轉染TIKI2恢復其表達后促進β-catenin的磷酸化和減少細胞核β-catenin表達，抑制了骨肉瘤細胞的增殖。同時在荷瘤鼠實驗中使用Wnt激活劑后能減弱TIKI2對瘤體的生長抑制作用，表明TIKI2對骨肉瘤的抑制作用是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮作用的。在活性酶的水平上進行調控是一高效的方法，環氧化酶COX-2和TIKI2蛋白酶均能抑制Wnt/β-catenin信號通路活性，從而抑制骨肉瘤細胞的活性，對骨肉瘤的治療具有很好的應用價值。

3.微小RNA：越來越多的研究表明微小RNA(miRNA)失調和Wnt/β-catenin信號通路共同推動癌癥的發生、轉移和耐藥性。miRNA具有定向調節基因表達作用，通過對基因的修飾，一些miRNA啟動子含有Wnt信號通路中細胞信號分子的特異性結合位點，能激活或抑制Wnt信號通路的各步驟。就腫瘤的發病和預后而言，miRNA可以扮演癌基因或抑癌基因的角色，而miRNA主要在轉錄后水平調節基因的表達且與骨肉瘤的發病機制相關，具有更優越的應用前景。Li等[27]研究表明miR-370作為腫瘤抑制因子，miR-370能夠靶向抑制FOXM1與β-catenin相結合形成的復合物，抑制β-catenin從細胞質轉移到細胞核，抑制轉錄因子TCF/LEF的轉錄啟動，使Wnt/β-catenin信號通路失活，具有抑制腫瘤細胞生長和侵襲轉移作用。同時另有研究表明，miR-182能靶向作用HOXA9的轉錄后修飾，下調Wnt/β-catenin信號轉導，促進了人骨肉瘤細胞的凋亡。Yang等[28]研究發現miR-183具有抑癌功能，Wnt信號通路中的LRP6 mRNA 3′-UTR含有保守的miR-183結合位點，MiR-183通過直接靶向其3′-UTR來下調LRP6的表達使Wnt/β-catenin信號轉導通路失活。當LRP6過表達后具有逆轉miR-183對腫瘤抑制作用，表明miR-183 能使Wnt/β-catenin信號轉導途徑失活，抑制骨肉瘤細胞的生長、遷移和侵襲作用。Zhang等[29]研究表明miR-107能夠靶向作用于Dkk-1的 3′-UTR區域，miR-107的過表達可以促進Dkk-1的表達，而Dkk-1為競爭性結合LRP 5/6關閉了Wnt/β-catenin信號通路，抑制骨肉瘤細胞的生長。綜上研究表明，miRNA通過靶向結合Wnt信號通路的不同分子，對通路相關分子進行基于水平的修飾而影響骨肉瘤細胞的生長。

4.其他:圍繞以抑制Wnt/β-catenin信號通路而使骨肉細胞的生長受抑制，Yong等[30]研究發現，癌癥亮氨酸拉鏈下調因子1(LDOC1)表達增加與Wnt5a水平降低相關，降低了骨肉瘤細胞的肺轉移能力。上調骨肉瘤LDOC1表達，減少Dvl2和Wnt5a的表達，而Dvl2和Wnt5a都是Wnt信號通路蛋白并參與腫瘤侵襲和轉移，從而表明LDOC1可以通過直接/間接與Wnt信號通路相互作用調節骨肉瘤的侵襲轉移。Zhang等[31]研究表明，RAS蛋白家族RASSF4在骨肉瘤組織和細胞中低表達，RASSF4過表達顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖，遷移和侵襲以及EMT過程。同時，RASSF4過表達顯著降低骨肉瘤細胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的蛋白表達，表明RASSF4是通過Wnt/β-catenin信號通路抑制骨肉瘤的活性。以上研究表明，調節因子和拮抗劑在抑制Wnt/β-catenin信號通路的同時也具有抑制骨肉瘤的活性，具有很好的應用前景。

三、展 望

信號通路是當今生物醫學研究領域較活躍的主題之一，經典的Wnt/β-catenin信號通路是一條研究較明確的通路，以往大量研究證明Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是導致骨肉瘤發病的機制之一，為臨床骨肉瘤的治療提供了一個潛在的治療思路。但目前仍處于實驗和探索階段，缺乏相關的臨床試驗。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑能夠通過調節通路信號分子而失活，抑制骨肉瘤細胞增殖，促進骨肉瘤細胞凋亡。這些實驗數據證實了Wnt/β-catenin信號通路是治療骨肉瘤很有前景的治療策略。因此，在大量實驗研究的基礎上，可以進行基于Wnt/β-catenin信號通路的前期臨床試驗研究，進一步證明Wnt/β-catenin信號通路是治療骨肉瘤有效的靶點，為臨床上應用Wnt/β-catenin信號通路治療骨肉瘤提供一個有力的依據。此外，當前的研究多集中在單信號通路之間的抑癌作用，不同信號通路之間的交互作用需進一步探討。也有研究表明此通路參與人體正常生理反應，抑制該通路時是否會同時帶來其他的不良反應需進一步研究[13]。不同抑制劑在體外的作用效果當在復雜的體內生理環境下是否具有同樣的效果，需開展相關的動物實驗及臨床試驗進行驗證。因此，隨著相關機制不斷深入研究，人們可以從更多的角度進行探索骨肉瘤的治療靶點，并獲得基于該靶點治療骨肉瘤的可能，將為人類戰勝腫瘤提供新的希望。