膽囊Cajal樣間質細胞與膽囊膽固醇結石形成關系的研究進展

趙健楠，范 瑩，吳碩東

(中國醫科大學附屬盛京醫院普外二科，沈陽 110004)

西方成年人群膽囊膽固醇結石(cholesterol gallstone，CG)的發病率為10%～15%[1]。中國人群CG的發病率為4.42%～11%，呈顯著上升趨勢[2]。CG的病因復雜，主要包括膽汁膽固醇過飽和、膽固醇晶體析出過程加速及膽囊動力障礙等，其中膽囊動力障礙是CG形成的關鍵因素。研究表明，膽囊運動障礙為膽汁析出和膽固醇結晶提供了空間與時間[3]。至今，對膽囊動力調控的研究大多集中于對膽囊收縮素(cholecystokinin，CCK)敏感性下降、膽囊平滑肌功能減退、CCK受體功能失調以及肝外膽道系統調節功能紊亂等方面。研究發現，消化道Cajal間質細胞(interstitial Cajal cell，ICC)廣泛存在于人類及其他哺乳動物消化道中[4-5]。有學者將消化道外器官分布的ICC命名為Cajal樣間質細胞(interstitial Cajal-like cell，ICLC)，另有學者為區別于其他間質細胞，也將ICLC稱為特絡細胞[6]。Lavoie等[7]在豚鼠膽囊中發現了ICLC。Pasternak等[8]在人體膽囊組織中發現了ICLC，并認為其與膽囊產生和傳播自發性節律有關。近年來，膽囊ICLC的功能及其與CG形成的關系成為研究熱點。現就ICLC與CG形成的關系予以綜述，以期為深入研究ICLC功能以及CG的病因提供參考。

1 膽囊ICLC的概述

1.1膽囊ICC/ICLC的發現 ICLC最早由西班牙神經解剖學家Santiago Ramony Cajal在動物消化道中發現，隨后有研究在膽囊組織中發現了類似細胞[7-8]。Sun等[9]采用透射電子顯微鏡成像、反轉錄-聚合酶鏈反應及蛋白質印跡法等技術對鼠類膽囊的研究發現，鼠類膽囊中的ICLC呈網狀結構，且存在豐富的核周內質網、游離核糖體、線粒體等。Lavoie等[7]利用免疫組織化學、透射電子顯微鏡及激光共聚焦影像技術在豚鼠膽囊及膽道系統中發現了與胃腸道ICC相似并沿膽囊平滑肌肌束和神經纖維走行的ICLC，研究還發現膽囊肌層的自發性節律性電活動可以被Kit受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷，表明ICLC在膽囊肌層節律性興奮的產生和傳導中起重要作用。

1.2ICC/ICLC的特異性標志物 對ICC的早期研究常采用甲基藍、嗜銀染色、Champy-Maillet法等方法觀察ICC形態和分布，但特異性不高[4]。近年來，ICC基因表達產物c-kit(CD117)成為目前公認的ICC特異性標志物[10]。通過特異性更高的c-kit抗體免疫組織化學染色法對其進行深入研究。

1.3ICC/ICLC與干細胞因子(stem cell factor，SCF)/c-kit信號通路的關系 ICC表達特異性標志物酪氨酸激酶受體c-kit，其配體為SCF。SCF/c-kit信號通路在ICC的發育、分化及表型維持中起重要作用。c-kit發生自發性突變或應用c-kit抗體阻斷c-kit的作用，均可引起c-kit活力顯著下降，導致ICC無法正常發生及發育。將c-kit中和抗體ACK-Ⅱ注射至新出生小鼠腹腔的研究發現，小鼠腸道正常位相收縮紊亂、慢波活動消失，ICC缺失[11]。此外，ICC培養微環境中足量SCF對ICC的發生、發育及表型維持也至關重要[12]。

目前，主要研究的c-kit/SCF下游通路是SFK(Src家族激酶)途徑、磷脂酰肌醇-3-激酶途徑、磷脂酶C途徑、Ras/Raf-1/MAP途徑、Jak-STAT信號轉導途徑，以上途徑在ICC發育、表型維持和功能調控中的作用有待進一步研究。

1.4ICC/ICLC的功能 ICC在消化系統中主要具有起搏平滑肌動力、推進電活動傳播以及介導和調節神經遞質等功能[13]。研究發現，ICC/ICLC數量減少可能與多種疾病相關，如空腸節段性擴張[14]、胃輕癱[15]、腹裂相關腸動力障礙[16]等。

1.4.1起搏慢波電位 胃腸道平滑肌有慢波和功能性兩種電位，慢波電位又稱基本電節律。ICC作為胃腸道的節律起搏點，具有維持周期、自發性去極化及產生慢波電位等特點[17]。有研究顯示，移除ICC的平滑肌組織完全或幾乎完全失去慢波電位[18]。Balemba等[19]的研究表明，ICLC作為膽囊收縮節律的起搏細胞，參與慢波電位的產生。Fan等[20]發現，ICLC受損的膽囊肌條中，慢波的幅度和頻率均明顯下降，提示ICLC在膽囊平滑肌節律性興奮的產生和轉導中起重要作用。

1.4.2慢傳導波電位 縫隙連接將ICC與神經元及平滑肌細胞廣泛連接，構成細胞間信號轉導的結構基礎。移除小腸平滑肌遠端ICC并保留近端ICC的研究顯示，近端可觀察到慢波電位，而遠端慢波電位消失，提示ICC是慢波電位傳導的基礎，平滑肌細胞間不能傳導慢波電位[21]。目前認為，慢波電位通過ICC網絡結構在平滑肌細胞間轉導，并可調節平滑肌的收縮[22]。

1.4.3介導神經信號轉導 ICC/ICLC可能還與神經信號的轉導有關。有研究發現，ICC位于自主神經元末端與肌細胞之間，與外部神經元形成類似于經典突觸的連接，此結構具有與興奮性神經元釋放的速激肽配位的受體，并對抑制性神經元釋放的一氧化氮敏感[23]。Faussone-Pellegrini[24]通過精確測量發現，ICC與平滑肌細胞以及神經細胞之間的連接距離僅為20～30 nm，遠遠小于通常神經-肌肉細胞的連接間隙(50～100 nm)，提示ICC可能在神經信號轉導中起重要作用。

2 膽囊ICLC變化與膽囊動力障礙的關系

2.1ICLC丟失導致膽囊動力障礙 膽囊ICLC數量減少可減弱其在膽囊動力調節機制中的作用，導致膽囊動力障礙。Pasternak等[25]的研究發現，與需手術切除膽囊的非膽囊結石患者相比，膽囊結石患者膽囊肌層ICLC數量顯著下降。臺劍熊等[26]的研究發現，與非膽囊結石人群相比，膽囊結石患者的膽囊收縮率及膽囊ICLC數量均顯著降低。Huang等[27]將30只豚鼠分為高膽固醇飲食的實驗組和標準飲食對照組，CG形成過程中，膽囊頸至膽囊底部ICLC數量明顯減少，凋亡數量顯著上升，表明ICLC數量可能影響膽囊ICLC的功能。彭雅亞和譚宇彥[28]的研究顯示，膽囊結石患者平滑肌中ICLC的數量較正常人群明顯減少，但目前膽囊結石形成過程中ICLC減少的具體原因尚不確定。有研究認為，膽囊結石形成過程中ICLC減少可能與ICC表型轉化有關[29]。目前認為，氧化應激反應、c-kit/SCF通路抑制、膽汁組成成分變化以及炎癥反應是CG形成過程中ICLC丟失的主要原因。

2.1.1氧化應激反應導致ICLC丟失 CG形成過程中，膽囊組織的氧化應激反應可能導致ICLC凋亡，數量下降。譚宇彥和嵇振玲[30]通過構建CG模型兔的研究發現，與正常飲食兔相比，CG模型兔膽囊ICLC數量明顯減少，且ICLC超微結構改變，網絡結構被破壞；進一步將ICLC置于不同膽固醇濃度細胞培養液的研究發現，隨著培養液膽固醇濃度的逐漸升高，ICLC抗氧化應激指標超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力逐漸下降，各組ICLC凋亡率明顯升高，兩者均呈劑量依賴性。在相同膽固醇濃度培養液中加入不同濃度膽固醇清除劑發現，ICLC抗氧化應激指標超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活力逐漸升高，且 ICC凋亡率逐漸下降，提示CG形成過程中，膽固醇濃度升高可誘發膽囊組織氧化應激反應，使ICLC不斷凋亡，導致膽囊ICLC數量顯著減少。但Kaji等[31]對于鼠類空腸ICC的研究顯示，由γ干擾素及脂多糖介導的ICC功能障礙在很大程度上由一氧化氮誘導的氧化應激反應所致，一氧化氮通路只降低ICC標志物的表達，并不破壞ICC超微結構，也不導致ICC凋亡。因此，氧化應激反應與膽囊動力障礙的關系仍有待進一步研究。

2.1.2c-kit/SCF通路抑制導致ICLC丟失 高膽固醇濃度可抑制c-kit/SCF通路，影響ICLC發育，使ICLC數量下降。Tan等[32]測定18例行腹腔鏡膽囊切除術患者(試驗組)和14例行手術治療胰頭腫瘤患者(對照組)術前超聲膽囊排空分數的研究發現，試驗組膽囊排空分數低于對照組；利用免疫組織化學法觀察膽囊標本發現，與對照組相比，試驗組患者膽囊ICLC數量明顯降低；利用反轉錄-聚合酶鏈反應及蛋白質印跡法對膽囊標本的研究發現，試驗組患者膽囊信使RNA及蛋白質水平的c-kit/SCF表達均明顯下降，表明下調c-kit/SCF信號通路對減少膽囊ICLC數量具有關鍵作用。Fan等[20]研究發現，高膽固醇飲食動物模型的c-kit及SCF表達水平均明顯下降，表明高膽固醇飲食可能通過影響ICLC發育致ICLC受損。Feng等[33]將45只豚鼠等分為標準飲食組、高膽固醇飲食組及茵陳蒿處理組的研究發現，與茵陳蒿處理組相比，高膽固醇飲食組 c-kit 表達及膽囊動力均明顯下降，提示茵陳蒿可通過上調c-kit表達保護膽囊動力。另有研究顯示，多能干細胞對消化系統受損ICC具有修復作用，并可促進其發生、發育，有助于ICC功能恢復，為細胞學層面膽囊結石及消化道疾病的研究提供新的治療靶點[34]。

2.1.3膽汁組成成分變化導致ICLC丟失 不同膽汁組成成分可影響膽囊ICLC數量。Pasternak等[35]對30例因CG行腹腔鏡膽囊切除術患者(試驗組)和25例因其他疾病切除膽囊患者(對照組)的研究發現，試驗組膽囊組織ICLC數量明顯低于對照組；此外，試驗組膽汁甘膽酸和牛磺膽酸水平較對照組明顯降低，且ICLC數量與甘膽酸和牛磺膽酸水平成正比，提示膽汁中甘膽酸和牛磺膽酸對ICLC具有保護作用。在成石過程中，膽汁甘膽酸和牛磺膽酸水平降低，過飽和膽汁毒性作用使ICLC數量減少，可見膽汁組成成分對膽囊ICLC數量減少起關鍵作用。Pasternak等[36]對25例行腹腔鏡膽囊切除術CG患者(試驗組)和15例行手術治療胰頭腫瘤患者(對照組)的研究發現，試驗組膽囊壁ICLC數量明顯低于對照組；進一步分析膽汁成分發現，膽汁結晶患者膽固醇飽和指數(表示膽汁成石性)明顯升高，試驗組患者膽囊甘膽酸和牛磺膽酸的平均水平顯著降低，且磷脂分數中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)的水平明顯升高，兩組患者ω-3 PUFA水平比較差異無統計學意義，但試驗組ω-6 PUFA水平及ω-6/ω-3 PUFA比率均明顯升高，提示膽囊固有肌層ICLC數量與總PUFA、ω-6 PUFA水平以及ω-6/ω-3 PUFA比率可能存在潛在關聯。

有研究顯示，高攝入量飽和脂肪酸及反式脂肪酸可導致膽囊結石的發生[37-38]，而高攝入量的PUFA及單不飽和脂肪酸則可降低膽囊結石的患病風險[39]。研究表明，膽囊結石患者膽汁ω-6 PUFA的升高是影響膽囊ICLC密度的重要因素，可能是CG發展的病理生理學因素之一。過飽和膽汁的毒性作用可能導致ICLC數量降低，而其他膽汁成分，如ω-3 PUFA、甘膽酸與牛磺膽酸等對ICLC具有保護作用，可能是影響膽囊及肝外膽管動力調節機制的因素。

2.1.4炎癥反應致ICLC丟失 膽囊壁的慢性炎癥過程可能是ICLC數量減少的重要機制之一。邱虎等[40]對急性膽囊炎模型的研究發現，與正常膽囊相比，急性膽囊炎模型膽囊各部位ICC的數量均減少。研究表明，與高膽固醇飲食組相比，可通過降低熊去氧膽酸處理組腫瘤壞死因子-α水平以及減少炎癥細胞浸潤保護膽囊ICLC，可見過飽和膽汁及疏水膽汁酸可促進膽囊的炎癥作用，腫瘤壞死因子-α的釋放可激發腫瘤壞死因子-α/胱天蛋白酶8/胱天蛋白酶3的級聯反應，誘導ICLC凋亡[41]。

Portincasa等[42]的研究提示，膽囊動力受損是輕度炎癥作用的結果。炎癥因子通過影響ICC細胞的微環境改變其表型，Toll樣受體4、脂多糖及腫瘤壞死因子-α均參與其中[43-44]。此外，Pasternak等[36]發現，結石患者膽囊及其固有肌層中存在炎癥浸潤，且炎癥浸潤與肥大細胞數量顯著升高有關。但Pasternak等[25]的研究發現，ICLC細胞減少與炎癥級別或肥大細胞數量無關。因此，炎癥反應與ICLC數量減少的相關性有待進一步研究確定。

2.2ICLC起搏電位減弱導致膽囊動力障礙 胞內鈣離子紊亂及炎癥反應可引起ICLC起搏電位減弱，最終導致膽囊動力障礙。膽囊膽固醇結石形成過程中，細胞膜穴樣凹陷中過量的膽固醇可能降低細胞膜的流動性，進一步使胞質內鈣平衡紊亂[45]。有研究證實，鈣離子在單個ICC慢波產生中起重要作用，三磷酸肌醇受體在ICC中大量表達，通過調節鈣離子的釋放調控起搏電流[46]。大量鈣離子是ICLC產生自發電活動的必需物質，ICLC細胞膜與胞質內鈣平衡紊亂可導致ICLC膜電位擺動障礙，影響ICLC的起搏功能[47]。此外，炎癥反應也可影響ICC的起搏，Kaji等[31]對于鼠類空腸ICC的研究顯示，由γ干擾素和脂多糖介導的炎癥反應可誘導炎癥前體細胞因子的表達，使ICC的起搏活性降低。

2.3ICLC對CCK反應性降低導致膽囊動力障礙 CG成石過程中，膽囊ICLC對CCK的低反應性可導致膽囊動力下降。Xu等[48]對豚鼠膽囊的研究表明，膽囊組織中ICLC表達CCK-A受體；在體外CCK激發實驗中，膽囊組織對CCK-A具有明顯的收縮反應；而相同條件下，去除ICLC的膽囊組織對CCK-A的收縮反應明顯下降，表明ICLC可能介導CCK對膽囊組織的收縮作用。Fan等[20]研究證實，膽囊ICLC在CCK-8引起的膽囊收縮中起關鍵作用，而結石膽囊中ICLC數量下降可能影響CCK對膽囊組織的收縮作用，導致膽囊運動障礙。另有研究表明，高膽固醇膽汁可使膽囊CCK-A受體表達水平下降，提示高膽固醇膽汁可通過下調ICLC以及平滑肌CCK-A受體的表達降低膽囊平滑肌對CCK的反應性，導致膽囊動力障礙[49]。

3 小 結

目前，對CG成因的研究較廣泛，但具體機制尚未完全闡明[50]。CG的形成由多種因素引起，膽囊動力下降是重要因素之一。高膽固醇飲食導致的膽囊動力下降可在很大程度上下調SCF和ICLC表面受體c-kit的水平，導致膽囊ICLC網絡受損。但高膽固醇飲食調節SCF及c-kit表達的機制尚不清楚，ICLC數量減少的機制及其具體細胞生物學變化仍不清楚。CG形成過程中ICLC數量減少的具體機制，ICLC的數量與SCF/c-kit下游通路在分子水平的關系，ICLC與神經調節及激素調節等具體的作用機制等均有待進一步研究。對ICLC和CG關系的研究具有十分廣闊的學術前景，可為進一步有效預防和治療CG提供新的切入點。