Tim-3介導腫瘤免疫逃逸和免疫治療的研究進展

李 霞, 陳治中, 何松哲, 李 政

(1.桂林醫學院附屬醫院檢驗科，廣西 桂林 541001； 2.廣西中醫藥大學瑞康臨床醫學院，南寧 530011；3.廣西壯族自治區人民醫院檢驗科，南寧 530021)

免疫治療是當前腫瘤免疫學的研究熱點，可通過識別和抑制腫瘤提高機體免疫功能，但免疫抑制狀態的存在成為免疫治療的最大障礙，因此探究免疫抑制的形成機制及其有效逆轉模式是當前腫瘤防治有待解決的關鍵問題[1]。T細胞免疫球蛋白黏蛋白(T cell immunoglobulin domain and mucin domain，Tim)-3在免疫細胞和腫瘤微環境中高表達，不僅調控機體的免疫功能，還參與腫瘤的免疫逃逸和侵襲轉移，與腫瘤臨床分期和治療轉歸密切相關，調控Tim-3相應信號通路的生物學特征有助于激活T細胞的功能和活性，抑制腫瘤生長[2-3]?，F就Tim-3及其配體的分子特征和功能以及Tim-3介導腫瘤免疫逃逸和免疫治療的研究進展予以綜述，以期為腫瘤免疫靶向治療提供依據和新的思路。

1 Tim-3的分子特征及其表達

Tim-3屬于Tim家族中具有共同基序的Ⅰ型跨膜糖蛋白，于2002年首先在活化的輔助性T細胞(helper T cell，Th細胞)1中發現，被認為是Th1細胞特定表達的一類抑制性分子[4]。隨后有研究發現，Th1細胞、Th17細胞、CD8+T細胞、調節性T細胞上均可檢測到Tim-3表達，甚至自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、肥大細胞以及腫瘤相關巨噬細胞等表面也存在Tim-3的表達，表明Tim-3不僅參與機體適應性免疫反應的調控，還參與機體天然免疫反應的調控[5]。進一步研究發現，Tim-3在多種實體腫瘤細胞表面也有表達[2-5]。Tim-3還可以可溶性方式分泌到細胞外，但其在細胞外的生物學功能尚不確定[6]。

人體內Tim-3分子是由301個氨基酸構成的跨膜糖蛋白，其結構包括免疫球蛋白域、細胞外的糖基黏蛋白、跨膜區和細胞內的C短尾部(由酪氨酸組成保守信號基序)[2-3]。Tim-3通過細胞外免疫球蛋白域與其配體相互作用，免疫球蛋白域在二硫鍵作用下，由6個半胱氨酸殘基構成一個與配體結合的“口袋”樣結構，該結構是Tim家族的特征性識別結構[7-8]。Tim-3通過與其配體相互作用誘發一系列信號傳遞，并與T細胞受體(T cell receptor，TCR)信號鏈相互作用，從而抑制免疫細胞功能，誘導T細胞、NK細胞等免疫活性細胞的凋亡，參與腫瘤免疫抑制、自身免疫性反應、變態反應、移植排斥反應等多種免疫性疾病的發生發展[9]。

2 Tim-3配體及其相互作用

Tim-3配體通過與Tim-3免疫球蛋白域的相互作用發揮生物學活性功能。Tim-3配體主要有3種，其中研究最早、最主要的Tim-3配體是半乳凝素-9(galectin 9，Gal-9)，之后發現有高遷移率組蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)和癌胚抗原細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule-1，Ceacam-1)[3,10]。Tim-3在外周血和腫瘤微環境中呈高表達，通過與配體相互作用轉導抑制性信號來調控免疫功能[11]。然而，Tim-3傳導共刺激信號和發揮免疫抑制作用是否必須依賴與配體的交聯、Tim-3與各配體結合是否具有協同效應和交叉對話等還需要大量試驗研究的闡明。

2.1Gal-9 Gal-9是首個被識別的Tim-3天然配體，屬于S型凝集素，由兩個糖基識別結構域通過一條肽鏈相連而成，是一種廣泛性表達的可溶性分子，可以不同程度在腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)、抗原呈遞細胞、調節性T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、內皮細胞中表達[12]。糖基化的Tim-3的免疫球蛋白域可與Gal-9相互作用，引起Tim-3胞內段結合的HLA-B關聯轉錄因子3(HLA-B associated transcript 3,BAT3)發生解離，刺激鈣離子進入活化的T細胞內，通過誘導T細胞凋亡抑制T細胞介導的免疫反應[13-14]。在小鼠模型中發現，Tim-3和Gal-9表達下降與促炎細胞因子[腫瘤壞死因子-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1β]增加以及抗炎細胞因子(轉化生長因子-β和IL-10)下降相關；同時還發現，巨噬細胞向M1型極化增加，而用Gal-9進行重組處理后則出現相反現象，由此推測，Tim-3/Gal-9信號通路可通過調控細胞因子分泌和巨噬細胞極化參與腫瘤的生長和侵襲轉移[15]。但其因果關系仍需通過分別阻斷腫瘤模型的Gal-9和Tim-3并檢測阻斷前后各種細胞因子的變化水平及其與M1極化的關系來闡明。

2.2HMGB1 HMGB1是定位于細胞核內的非組蛋白成分，其對腫瘤、感染等損傷性刺激異常敏感，可由活化的DCs釋放，介導腫瘤細胞和感染細胞等釋放的進入細胞核囊泡的核酸內吞，可清除免疫原性物質，在抗腫瘤和抗感染免疫中起橋梁作用[16]。與正常組織DCs相比，腫瘤微環境中浸潤的DCs可高表達Tim-3，且Tim-3與腫瘤細胞釋放的核酸性抗原競爭性結合HMGB1的同一結構域，可阻斷核酸與HMGB1復合物的形成，抑制HMGB1介導的核酸進入核內囊泡的固有免疫信號轉導[17]。因此，可將阻斷Tim-3/HMGB1信號通路(即解除腫瘤微環境中DCs對腫瘤釋放核酸所激發免疫反應的抑制作用)作為開發預防腫瘤DNA疫苗和腫瘤化療的理論依據。一項對白血病的研究發現，Tim-3/HMGB1通路可通過影響腫瘤壞死因子-α和IL-1β的分泌促進急性髓系白血病細胞的免疫逃逸[18]。

2.3Ceacam-1 Ceacam-1廣泛分布于免疫細胞、上皮細胞和腫瘤細胞上，可以跨膜形式存在于細胞上，也可以分泌形式存在于體液中，通過細胞間黏附作用轉導信號，參與細胞增殖、分化、凋亡，并可參與管腔結構形成以及調節免疫反應[2-3]。Ceacam-1可以與糖基化Tim-3免疫球蛋白域的FG-CC環結合，以傳遞免疫抑制信號和誘導免疫耐受[2-3]。Tim-3/Ceacam-1的相互作用可產生與Tim-3/Gal-9通路類似的效應，也可引起Tim-3胞內段結合的BAT3發生解離，刺激鈣離子進入活化的T細胞內而誘發凋亡[13]，可見，Tim-3/Ceacam-1和Tim-3/Gal-9信號通路可能存在協同效應。Tim-3上HMGB1結合域與Ceacam-1結合域的結構存在重疊，Tim-3配體結構域“FG-CC環”中的Q62 (人類是E62)是Tim-3與HMGB1和Ceacam-1相互作用的必需氨基酸殘基[13,19]。目前，Tim-3與配體HMGB1和Ceacam-1之間是否存在競爭性結合及交叉對話尚不清楚，表明HMGB1和Ceacam1介導的Tim-3信號通路的細胞類型特異性尚有待進一步研究的確認。對結腸癌、非小細胞肺癌等實體腫瘤研究證實，Ceacam-1和Tim-3單克隆抗體聯合阻滯可有效增強抗腫瘤免疫應答[19-20]。

3 Tim-3與免疫細胞介導的腫瘤免疫耐受

Tim-3與其配體相互作用后可傳遞抑制信號，發揮抑制免疫細胞功能、減少促炎細胞因子產生、抑制免疫細胞增殖的作用，然而通過Tim-3單克隆抗體尤其是聯合使用程序性細胞死亡受體-1(programmed cell death-1，PD-1)單克隆抗體阻斷其相互作用可增加細胞因子產生、促進細胞增殖、抑制腫瘤生長[13,21]。但對感染結核小鼠模型的研究發現，Tim-3可傳遞相反信號而促進巨噬細胞的抗感染免疫，并在Gal-9陰性巨噬細胞上喪失此功能[22]。目前，Tim-3免疫抑制作用的機制尚不明確?，F對T細胞、NK細胞、TAMs及髓源抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)與Tim-3的可能腫瘤免疫耐受和逃逸機制予以闡述。

3.1Tim-3與T細胞 T細胞可在局部微環境和體液因子等的調控下分化為成熟免疫細胞和效應細胞，調控機體的體液免疫和細胞免疫[23]。Tim-3信號通路及其與TCR信號的耦合機制對T細胞功能的影響還有待探索，尚無統一定論。動物實驗研究認為，Tim-3與Gal-9等配體結合可使結合在Tim-3細胞尾部的BAT3解離，TCR信號和CD28共刺激信號可激活非受體酪氨酸激酶Src家族成員Lck和Fyn信號分子，促進Tim-3胞內保守絡氨酸殘基(鼠類Y256和Y263位點，人類Y265和Y272位點)的磷酸化，進而招募P85接頭蛋白來促進磷脂酰肌醇-3-激酶的活化，從而促進Tim-3+T淋巴細胞的增殖和活化[2-3,24]。對Jurkat細胞的研究發現，Tim-3+Jurkat細胞與Gal-9相互作用可抑制TCR信號介導的活化T細胞核因子和核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)的活化，進而抑制T細胞的活性[2-3]。將經CD3/CD28激活的人外周血單個核細胞與脂肪干細胞共同培養發現，CD4+T細胞和CD8+T細胞的PD-1和Tim-3表達增加，NF-κB磷酸化水平、細胞增殖能力、γ干擾素的產生均降低，細胞凋亡增加；而經抗程序性細胞死亡配體-1和Gal-9單克隆抗體阻斷后，CD4+T細胞和CD8+T細胞的NF-κB磷酸化、細胞增殖能力、γ干擾素產生均恢復，且細胞凋亡降低，證實Tim-3/Gal-9可通過調控NF-κB的活化來調控T細胞的功能和活性[25]，但該實驗并未研究分別阻斷PD-L1/Gal-9/NF-κB、Tim-3/Gal-9/NF-κB以及TCR信號通路對細胞凋亡的影響。

Tim-3相關信號通路對免疫細胞的調節可能受到免疫細胞種類及其活化狀態的影響。肺細胞癌患者T細胞高表達Tim-3與T細胞耗竭有關，抗體阻斷Tim-3/Gal-9信號通路后可逆轉T細胞耗竭狀態[5,26]。與單獨應用Tim-3或PD-1單克隆抗體相比，Tim-3與PD-1單克隆抗體聯合應用的抗腫瘤作用以及對T細胞功能恢復的作用明顯增強，可能與腫瘤浸潤性淋巴細胞共表達PD-1、細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)、Tim-3等抑制分子，且其聯合阻斷可有效恢復機體的抗腫瘤免疫功能有關[21,27]。

3.2Tim-3與NK細胞 腫瘤患者外周血和腫瘤微環境浸潤的NK細胞高表達Tim-3，幾乎所有的成熟CD56dimCD16+NK細胞均表達Tim-3，細胞因子IL-12、IL-15和(或)IL-18可誘導未成熟的CD56brightCD16-NK表達Tim-3，在腫瘤浸潤淋巴細胞中，NK細胞表達Tim-3的比例最高，故認為Tim-3是NK細胞成熟和活化的標識[2]。NK細胞中的Tim-3與Gal-9結合后，胞內酪氨酸殘基尾部發生磷酸化，BAT3發生解離，可招募Src激酶成員Fyn到胞內同一結合位點，從而抑制Fyn信號對細胞增殖和活化的刺激，導致NK細胞耗竭[27]。但目前Tim-3對NK細胞功能的調節作用仍存在爭議。阻斷感染乙型肝炎病毒等慢性感染者的Tim-3，NK細胞毒性和γ干擾素的分泌能力增強[28]。Tim-3在黑色素瘤患者NK細胞中的表達也增加，但采用單克隆抗體阻斷Tim-3后，NK細胞呈耗竭狀態，且分泌γ干擾素的能力降低[29]。因此，NK細胞上Tim-3的功能尚有待進一步研究。

3.3Tim-3與TAMs 腫瘤微環境中可見大量的Tim-3+TAMs浸潤，TAMs的浸潤程度、極化狀態以及Tim-3的表達量均與腫瘤的發生和侵襲轉移相關[30-31]。TAMs衍生的IL-6可活化JAK激酶2/信號轉導及轉錄激活因子(signal transduction and activator of transcription，STAT)3信號，活化的STAT3轉錄抑制腫瘤抑制因子miR-506-3p(調控FoxQ1的關鍵微RNA)，導致FoxQ1表達增加，進而促進募集巨噬細胞的趨化因子(如CC趨化因子配體2)增加，使更多TAMs聚集在腫瘤微環境中，促進腫瘤的侵襲和轉移，通過阻斷CC趨化因子配體2或IL-6可破壞以上惡性循環，減少巨噬細胞聚集[32]?？梢姡[瘤微環境中巨噬細胞和腫瘤細胞的STAT3/miR-506-3p/FoxQ1/CC趨化因子配體2信號軸有望成為腫瘤治療及其免疫調控的關鍵靶標。

3.4Tim-3與MDSCs 在腫瘤微環境中，MDSCs產生的精氨酸酶1、一氧化氮合酶和活性氧類等有顯著的免疫抑制作用，并與腫瘤發展和患者預后密切相關[33]。對胃癌患者的研究證實，MDSCs上Tim-3的表達水平與腫瘤轉移及其臨床分期相關[34]。T細胞上Tim-3基因受CD2啟動子的驅動而呈過表達，可進一步誘導粒細胞樣MDSCs的產生，并參與腫瘤預后和轉歸[35]。對白血病的研究發現，T細胞表達的Tim-3可誘導MDSCs擴增，促進MDSCs分化為TAMs，而TAMs可通過細胞外基質重構、血管生成和淋巴管生成來促進腫瘤干細胞的增殖和存活。可見，在腫瘤微環境中，Tim-3可通過與TAMs和MDSCs協同作用介導腫瘤的免疫逃逸[36]。

4 Tim-3介導腫瘤免疫治療及其機制

免疫檢查點分子(如PD-1、CTLA-4和Tim-3)在腫瘤患者外周血單個核細胞以及腫瘤微環境腫瘤浸潤性淋巴細胞中的表達增多，其與相應配體結合后，通過Fyn/p85/磷脂酰肌醇-3-激酶等信號通路抑制免疫細胞功能，促進腫瘤的生長和侵襲轉移，應用單克隆抗體阻斷免疫檢查點分子與其配體相應信號通路后，可逆轉免疫細胞的耗竭，抑制腫瘤發展，為腫瘤治療中檢查點的阻斷提供依據[2-3,13,37-38]。

2011年，Ipilimumab作為抗CTLA-4免疫治療藥物被批準用于轉移性黑色素瘤的治療，但其治療有效率較低[2-3]。隨后，美國食品藥品管理局批準抗PD-1藥物Pembrolizumab用于黑色素瘤和頭頸鱗狀細胞癌的治療。Nivolumab是美國食品藥品管理局批準的第二種抗PD-1單克隆抗體，其對多種惡性腫瘤(非小細胞肺癌、黑色素瘤和腎細胞癌等)均具有治療作用，可使部分患者的腫瘤細胞呈迅速持久地消退。研究表明，Nivolumab和Ipilimumab聯合使用可顯著提高對惡性腫瘤的治療效果，與單獨使用Ipilimumab或Nivolumab相比，可顯著延長患者生存時間[13]。但需要重視因免疫治療導致的細胞毒性反應等不良反應，且抗PD-1和抗CTLA-4聯合治療僅對約50%的黑色素瘤患者有顯著療效，有些腫瘤患者對以上兩個檢查點阻斷治療均無反應[2-3]。

鑒于Tim-3在免疫細胞上的選擇性表達及其結構的獨特性，可以通過靶向治療提高其治療精確性并降低其非特異性細胞毒性反應。此外，Tim-3下游信號通路的抑制機制較明確，與CTLA-4和PD-1下游信號通路存在較大差異[2-3,32]。由此可見，Tim-3獨特的表達及其細胞內信號通路對靶向Tim-3的腫瘤免疫治療具有很大的應用潛力。

5 展 望

目前，基于免疫檢查點分子和腫瘤免疫的研究已經得到了大量的信息和數據，且正在進行腫瘤免疫治療方案的合理組合和嘗試，并取得了一定成果。在腫瘤免疫中，一些新型免疫抑制性共刺激分子(如淋巴細胞活化基因3、T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白、B和T淋巴細胞弱化因子等)的作用及機制尚不明確，其與Tim-3等分子的關系還需要進一步闡明[38]。此外，Tim-3及其配體信號通路結構和功能以及與淋巴細胞活化信號通路的交叉對話等問題尚未完全闡明，且尚缺乏聯合應用細胞因子等生物學活性因子治療方案的相關動物實驗和臨床試驗研究，阻斷抗Tim-3單克隆抗體的結局亦存在不確定性，因此，還需要大量的實驗研究以優化相關腫瘤免疫治療。