循環(huán)腫瘤細(xì)胞在卵巢上皮性癌中的研究進(jìn)展

童 萌，劉 青

(甘肅省婦幼保健院婦科，蘭州 730050)

卵巢癌是女性癌癥死亡的第五大原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)在美國(guó)，2017年卵巢癌的新發(fā)人數(shù)約22 440例[1]；在韓國(guó)，2004—2014年，卵巢癌的發(fā)病率從3.2/10萬(wàn)增加到4.8/10萬(wàn)[2]；而在我國(guó)，2015年約有52 100例新發(fā)病例，且有22 500例死亡[3]。而卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)是卵巢癌的主要類型，占卵巢癌的90%以上，有顯著的組織學(xué)和分子異質(zhì)性。由于早期癥狀不明顯，70%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，并伴有腹膜轉(zhuǎn)移，且無(wú)論對(duì)治療的初始反應(yīng)如何，最終均可以觀察到化學(xué)抗性[4]。EOC的治療仍以腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的化療為主，最新的治療方法包括貝伐單抗和聚ADP-核糖聚合酶奧拉帕尼，但手術(shù)的局限性和患者對(duì)化療藥物耐藥性的提高以及靶向藥物使用的局限性，使患者的5年生存率普遍低于35%，而5年復(fù)發(fā)率高達(dá)80%[5]；相反，早期(Ⅰ～Ⅱ期)患者的生存率高達(dá)90%[6]。因此，卵巢癌的早期診斷成為患者治療效果及預(yù)后評(píng)估的重要影響因素。臨床上常用糖類抗原125和人附睪蛋白4等腫瘤標(biāo)志物對(duì)EOC的診治效果及預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，但因其敏感性不高且缺乏特異性，故指導(dǎo)作用有限。近年來(lái)，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)的提出，為卵巢癌的早期發(fā)生、癌癥進(jìn)展和治療提供了新思路。現(xiàn)就CTCs與卵巢癌的早期診斷、個(gè)體化治療效果反應(yīng)及預(yù)后評(píng)估的關(guān)系予以綜述。

1 CTCs的概述

CTCs由Ashworth[7]于1869年首先提出；1976年，Nowell[8]將CTCs定義為來(lái)源于原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤，獲得脫離基膜的能力并通過(guò)組織基質(zhì)進(jìn)入血管的腫瘤細(xì)胞。CTCs體積大于外周白細(xì)胞，且核大，可見(jiàn)病理性核分裂象或多核巨細(xì)胞，在熒光顯微鏡下，4，6-二脒基-2-苯基吲哚、細(xì)胞角蛋白19呈陽(yáng)性。Fan等[9]及Poveda等[10]的研究顯示，CTCs同一細(xì)胞中會(huì)同時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞核4，6-二脒基-2-苯基吲哚陽(yáng)性的藍(lán)染和細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞角蛋白19陽(yáng)性的綠染。CTCs的分型包括上皮表型、間質(zhì)細(xì)胞表型、上皮與間質(zhì)混合表型及循環(huán)腫瘤微栓，Liberko等[11]的研究顯示，CTCs的形成、遷移、侵襲與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。CTCs是漂浮細(xì)胞群，其可從原發(fā)部位分離，并通過(guò)循環(huán)和淋巴系統(tǒng)傳播到整個(gè)身體，對(duì)失巢凋亡具有抗性。CTCs被認(rèn)為是轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞，分離不需要任何侵入性程序。基于EOC的性質(zhì)和位置，CTCs在EOC患者中的血液傳播途徑尚不清楚，同時(shí)酪氨酸激酶受體在EOC的CTCs形成中的作用尚未確定。近年來(lái)對(duì)CTCs的研究表明，從循環(huán)系統(tǒng)中捕獲酪氨酸激酶受體陽(yáng)性細(xì)胞是分離CTCs用于腫瘤細(xì)胞的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)表征的有效方法[12]。因此，酪氨酸激酶靶向分離CTCs將有助于癌癥治療方法的設(shè)計(jì)，確定癌癥患者對(duì)化療藥物效果的反應(yīng)和耐藥機(jī)制。但由于外周血中的CTCs從原發(fā)腫瘤流入脈管系統(tǒng)并以極低的濃度(僅占白細(xì)胞的1/106～1/107)在血流中循環(huán)，且在血液中呈現(xiàn)出很高的異質(zhì)性，故CTCs檢測(cè)技術(shù)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

2 CTCs的檢測(cè)

CTCs的檢測(cè)過(guò)程可分為細(xì)胞的富集及鑒定，目前為止，已有多種技術(shù)用于EOC中CTCs的富集和檢測(cè)，CTCs的分離或富集主要基于免疫磁性顆粒的大小，而CTCs的檢測(cè)主要基于免疫細(xì)胞化學(xué)法。其中，基于物理特性使CTCs分離或富集的新技術(shù)，如用于分離和檢測(cè)EOC患者CTCs的微流體裝置已在研究中得到應(yīng)用[13-14]；同時(shí)，基于微流體的ParsortixTM技術(shù)也已應(yīng)用于CTCs的檢測(cè)和富集。Nagrath等[15]用功能捕獲技術(shù)成功富集了116例患者中115例轉(zhuǎn)移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌患者外周血中的CTCs；同時(shí)，還有物理捕獲技術(shù)，如ISET、Dean Flow Franctionation檢測(cè)系統(tǒng)，也可富集外周血中的CTCs；此外，Katarina等[16]使用抗體捕獲技術(shù)分別對(duì)卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌患者進(jìn)行CTCs富集。富集分離后的CTCs需進(jìn)一步鑒定，目前常用的方法有免疫熒光標(biāo)記、RNA原位雜交、染色體核型鑒定等，它們可以對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)及分子學(xué)等進(jìn)行測(cè)定，以實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的定性及定量分析[17]。其中，免疫標(biāo)記法是最常用的方法，其利用上皮細(xì)胞的特異性抗體，對(duì)一種或多種抗體染色，從而鑒定出CTCs。常用的卵巢癌特異性抗體有細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞細(xì)胞黏附分子、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1、親環(huán)素C及葉酸受體α等。臨床上，研究者可以根據(jù)以上不同的卵巢特異性抗體，對(duì)CTCs做出選擇。食品藥品管理局采用依賴抗上皮細(xì)胞黏附分子對(duì)CTCs進(jìn)行選擇，并公布當(dāng)外周血CTCs≥2個(gè)/7.5 mL時(shí)為CTCs陽(yáng)性，這種方法主要用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌。然而，由于CTCs在上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中可導(dǎo)致上皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)下調(diào)，故會(huì)影響CTCs的捕獲。Po等[18]利用基于神經(jīng)鈣黏素的流式細(xì)胞儀檢測(cè)了卵巢癌患者的卵巢癌細(xì)胞系，結(jié)果表明單獨(dú)基于神經(jīng)鈣黏素分離出的CTCs是單獨(dú)使用上皮細(xì)胞黏附分子離出CTCs的2.1倍。Tsai等[19]首次采用新型微流體系統(tǒng)以卵巢癌CX-BG1-10-A適體包被的磁株為特征來(lái)捕獲血液的CTCs，此方法獲得的CTCs中白細(xì)胞明顯減少，且假陽(yáng)性率較CellSearch檢測(cè)方法低至少兩個(gè)數(shù)量級(jí)，故其成為一種有前景的檢測(cè)手段。而Obermayr等[14]為了提高CTCs富集的純度，開(kāi)發(fā)了一種富集CTCs的工作流程，即結(jié)合密度梯度離心和濃縮、ParsortixTM微流體技術(shù)及實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定聚合酶鏈反應(yīng)分析的方法，消耗CTCs中約106污染的白細(xì)胞，從而為臨床研究中CTCs的檢測(cè)和分子表征的探索進(jìn)一步提供了可靠的理論依據(jù)。

3 CTCs在卵巢癌早期診斷中的價(jià)值

目前，血清糖類抗原125和人附睪蛋白4是評(píng)估卵巢癌最常用的標(biāo)志物，但由于兩者單獨(dú)檢測(cè)缺乏敏感性和特異性，CTCs的檢測(cè)為患者提供了一種更為方便、無(wú)創(chuàng)及精準(zhǔn)的檢查方法。有研究顯示，在500例卵巢癌Ⅰ期患者中，血清糖類抗原125的陽(yáng)性率(65%)明顯低于CTCs，且卵巢癌早期(Ⅰ期、Ⅱ 期)的檢出率(82%和85%)明顯低于晚期(Ⅲ 期、Ⅳ期)(91%和100%)(P<0.05)，證明CTCs的增加與癌癥進(jìn)展相關(guān)[20]。Ried等[21]研究比較了CTCs計(jì)數(shù)與癌癥的狀態(tài)和風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果表明CTCs篩查檢測(cè)EOC的敏感性較高，且CTCs計(jì)數(shù)越多，則為惡性腫瘤的可能性越高。隨著時(shí)間的推移，CTCs的檢測(cè)也可用于評(píng)估治療的有效性。Pearl等[22]分離了129例術(shù)前卵巢癌患者的侵襲性循環(huán)腫瘤細(xì)胞(invasive circulating tumor cells，iCTCs)，結(jié)果顯示iCTCs在卵巢癌早期(Ⅰ～Ⅱ 期)患者中的特異度和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均高于糖類抗原125(98.1%比76.2%，77.8%比61.6%)。Guo等[23]及Suh等[24]的研究顯示，CTCs診斷早期卵巢癌的敏感性高于血清糖類抗原125。Gostner等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在早期診斷中卵巢癌患者的CTCs狀態(tài)與免疫系統(tǒng)功能也相關(guān)，如在CTCs陽(yáng)性患者中，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的生物標(biāo)志物(新蝶呤、色氨酸及犬尿氨酸)水平均顯著升高。上述研究表明，CTCs檢測(cè)在區(qū)分卵巢良惡性腫瘤和早期卵巢癌的診斷中發(fā)揮重要作用，且在很大程度上提高了EOC早期診斷的敏感性和特異性。

4 CTCs在卵巢癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用價(jià)值

卵巢癌治療過(guò)程中化療藥物耐藥性的提高及生物靶向治療的進(jìn)展使得CTCs在卵巢癌的個(gè)體化治療中呈現(xiàn)出獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。Aktas等[26]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者中CTCs表面的腫瘤抗原或分子標(biāo)志物可作為生物靶向治療的靶點(diǎn)。而Obermayr等[27]利用聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)CTCs進(jìn)行了檢測(cè)，鑒定了卵巢癌CTCs的新基因標(biāo)記，包括細(xì)胞周期素2基因、缺氧誘導(dǎo)基因、腫瘤相關(guān)膜蛋白2基因、T細(xì)胞分化蛋白2基因、酵母蛋白C基因和神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8 基因六種，其中酵母蛋白C基因陽(yáng)性的CTCs患者更可能出現(xiàn)鉑類藥物耐藥。Craescu等[28]研究指出，酵母蛋白A基因?yàn)槊庖咭种扑幬锃h(huán)孢素A的受體；隨后Lee和Kim[29]的研究證實(shí)，酵母蛋白A基因具有逆轉(zhuǎn)鉑類化學(xué)抗性的巨大潛力，其在各種癌癥中表達(dá)上調(diào)，與癌癥的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。而Zhang等[20]的研究顯示，血液CTCs數(shù)量隨著治療方法的變化而變化，且CTCs中上皮細(xì)胞黏附因子和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2的表達(dá)與化療的耐藥性相關(guān)。Katarina等[30]使用MetaCell技術(shù)通過(guò)基于熒光顯微鏡的細(xì)胞形態(tài)學(xué)評(píng)估結(jié)合相對(duì)基因表達(dá)分析來(lái)檢測(cè)CTCs，發(fā)現(xiàn)人角蛋白7基因、白血病基因、上皮細(xì)胞黏附分子基因、Mucin16、Mucin1、牛角蛋白18 和牛角蛋白19基因的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故得出根據(jù)不同基因的表達(dá)可以檢測(cè)出EOC患者中CTCs的表達(dá)情況，這些基因在作為輔助卵巢癌早期診斷潛在生物標(biāo)志物的同時(shí)，也可預(yù)測(cè)卵巢癌的治療反應(yīng)。

5 CTCs評(píng)估卵巢癌預(yù)后及復(fù)發(fā)的價(jià)值

EOC的轉(zhuǎn)移存在于所有實(shí)體惡性腫瘤中，包括腹膜腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞球體利用腹水轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移兩種途徑。血液中的CTCs不僅可以更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性和評(píng)估腫瘤的治療效果，還為治療后的反應(yīng)提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)CTCs不僅可以作為參與卵巢癌血行轉(zhuǎn)移的途徑，也有評(píng)估預(yù)后或預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的作用。Caixeiro等[31]的研究表明，血液中高水平的CTCs與結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌的疾病進(jìn)展與預(yù)后相關(guān)。而有薈萃分析顯示，卵巢癌患者CTCs陽(yáng)性計(jì)數(shù)與患者的總生存期、無(wú)進(jìn)展生存期及卵巢癌的分期相關(guān)[32-35]。莫美絨等[36]采用CellSearch系統(tǒng)檢測(cè)了56例卵巢癌患者術(shù)前血液中的CTCs，結(jié)果顯示，CTCs陽(yáng)性計(jì)數(shù)與腫瘤的分化程度、分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)情況獨(dú)立相關(guān)，且CTCs陽(yáng)性組患者5年生存率低于陰性組(47.62%比91.43%，P=0.032)。Pearl等[22]研究表明，iCTCs陽(yáng)性的EOC早期患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期與晚期患者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，iCTCs陽(yáng)性計(jì)數(shù)≥5個(gè)/mL患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期均明顯低于iCTCs陽(yáng)性計(jì)數(shù)<5個(gè)/mL的患者。此外該研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤分期、殘余病灶的大小及對(duì)鉑類化療藥物敏感的患者中，與糖類抗原125相比，iCTCs在判斷患者的總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期方面準(zhǔn)確性更高，提示iCTCs陽(yáng)性計(jì)數(shù)的升高與預(yù)后不良有關(guān)。一項(xiàng)針對(duì)2 000例EOC患者血液中CTCs的存在能否顯示微小殘留病灶的研究表明，CTCs陽(yáng)性患者的總生存期較CTCs陰性患者短[37]。Obermayr等[37]的多中心研究顯示，在術(shù)后經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)6個(gè)月化療的患者中，存在缺氧誘導(dǎo)基因且CTCs陽(yáng)性患者的無(wú)病生存期及總生存期均短于缺乏缺氧誘導(dǎo)基因且CTCs陽(yáng)性的患者，表明患者的CTCs狀態(tài)與無(wú)病生存期和總生存期緊密相關(guān)。Chebouti等[38]在基因水平研究了卵巢癌患者手術(shù)前和鉑類藥物化療后上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的CTCs發(fā)生率，而與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物包括磷脂酰肌醇-3-激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白-2激酶，結(jié)果表明磷脂酰肌醇-3-激酶陽(yáng)性的CTCs患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期顯著降低，且在手術(shù)后有殘余癌灶的患者中，可以觀察到上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化樣CTCs。上述結(jié)果均表明，CTCs的計(jì)數(shù)及狀態(tài)在評(píng)估卵巢癌預(yù)后方面有顯著優(yōu)越性。

6 展 望

CTCs是腫瘤細(xì)胞，其與原發(fā)性腫瘤分離并進(jìn)入血流。CTCs不與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合，且其由于失巢凋亡的抗性而在血流中存活，每107個(gè)血液元素大約存在1個(gè)腫瘤細(xì)胞，比較罕見(jiàn)。由于CTCs具有監(jiān)測(cè)創(chuàng)傷性小、可連續(xù)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，故可為卵巢癌的治療和預(yù)后提供相關(guān)信息。細(xì)胞角蛋白、上皮細(xì)胞細(xì)胞黏附分子、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白1等均為卵巢癌CTCs的分子標(biāo)志物，這些分子標(biāo)志物為卵巢癌的早期篩查、精準(zhǔn)化治療、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的判斷、尋找耐藥性的原因、評(píng)估卵巢癌術(shù)后或放化療的療效及預(yù)后提供了重要的理論依據(jù)。此外，CTCs的檢測(cè)為更好地理解細(xì)胞間的相互轉(zhuǎn)移提供了依據(jù)，對(duì)抗性遺傳改變的實(shí)時(shí)檢測(cè)過(guò)程提供了良好的參考價(jià)值。但由于可用樣品的量有限，缺乏統(tǒng)一檢測(cè)方法、參考標(biāo)準(zhǔn)及費(fèi)用昂貴，CTCs的檢測(cè)仍具挑戰(zhàn)性，故其在臨床婦科腫瘤方面尚未廣泛應(yīng)用。針對(duì)目前CTCs的分離、富集與鑒定方法仍不能滿足臨床工作的需要，故未來(lái)需進(jìn)一步提高CTCs檢測(cè)的敏感性和特異性，從而提高CTCs對(duì)卵巢癌的早期診斷價(jià)值；同時(shí)，希望以后有更多大規(guī)模的前瞻性研究來(lái)提高CTCs的生物學(xué)特性，以支持CTCs在卵巢癌的個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估及復(fù)發(fā)方面的臨床價(jià)值。