補腎止顫方聯(lián)合埋針對帕金森病大鼠行為學(xué)>及黑質(zhì)區(qū)自由基清除的影響

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帕金森病(Parkinson′s disease，PD)的主要病變在紋狀體及黑質(zhì)的多巴胺通路上，以中腦選擇性黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失為其主要病理改變[1]。PD確切的發(fā)病機制迄今尚未完全清楚，目前以自由基清除系統(tǒng)功能降低或失活為主要原因的相關(guān)學(xué)說占主導(dǎo)地位[2]。臨床運用補腎止顫方聯(lián)合埋針治療PD病人，病人情緒、運動功能和生活質(zhì)量明顯改善，臨床效果較好[3-4]，但其確切的作用機制尚未十分清楚。本研究參照劉雨清等[5]的蛋白酶抑制因子(proteasome inhibitors I，PSI)皮下注射法制作慢性PD大鼠模型，通過觀察各組大鼠行為學(xué)改變并測定其中腦黑質(zhì)區(qū)脂質(zhì)過氧化物(LPO)和谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性變化，探討補腎止顫方聯(lián)合埋針保護PD大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SPF級成年雄性SD大鼠50只(所需樣本40只，10只大鼠以備實驗過程中大鼠死亡時及時補充)，體重(250±20) g，均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心(scxk桂2009-0002)。實驗前所有大鼠均在通風(fēng)、溫度、濕度適宜的專用飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗過程中死亡大鼠及時以同批次大鼠補充。

1.1.2 主要藥品 補腎止顫方：鹿角膠10 g，生龜板20 g，黨參15 g，阿膠10 g，白芍30 g，枸杞子30 g，火麻仁15 g，生地25 g，麥冬15 g，肉蓯蓉30 g，生鱉甲15 g，黃精10 g，山萸肉10 g，天麻15 g，鉤藤30 g，炙甘草6 g，以上16味為單味免煎顆粒，均由江陰天江藥業(yè)有限公司制備(生產(chǎn)批號：1206003)；參照《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗動物學(xué)》[6]方法計算給藥量，把藥物配制成含生藥2.574 g/mL，大鼠灌胃液體量為每次1 mL/100 g。多巴絲肼片：每片250 mg(上海羅氏制藥公司生產(chǎn)，批號：SH1689)。埋針針具：選用圖釘型無菌撳針(順和牌無菌撳針，蘇州市華倫醫(yī)療用品有限公司，批號：12197)。

1.1.3 主要試劑 LPO試劑盒、GSH試劑盒、GSH-Px測定試劑盒、SOD試劑盒、總蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程公司)；PSI(Calbiochem公司)；其他試劑均為市售、分析純。

1.1.4 主要儀器 自動組織脫水機及組織包埋機(廣州市華俊醫(yī)療器械有限公司)，DB037-003型大鼠腦切片模具(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)，LEICA RM2235型組織切片機，9602G型國產(chǎn)酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn))，BX60型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 將40只SD雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組(10只)和造模組(30只)，造模組采用蛋白酶抑制因子皮下注射法制作PD模型后，隨機分為模型組、多巴絲肼組、針?biāo)幗Y(jié)合組，各10只。采用胡玉英等[4-5]研究的方法皮下注射蛋白酶抑制因子制作慢性PD大鼠模型。造模期間每日觀察并同時記錄各組大鼠的一般狀況(如精神狀態(tài)、反捕、飲食、體毛、肢體震顫、肢體活動、僵直等)，造模4周后， 參照 “網(wǎng)格試驗”[7]及平衡桿試驗方法[8]檢測大鼠的行為學(xué)變化，對各組大鼠進行行為學(xué)檢測，以判斷造模成功與否，其間死亡大鼠及時補充同一批次的大鼠；直至4周造模時間結(jié)束未出現(xiàn)行為學(xué)改變者為失敗模型，不納入本實驗，再隨機補充同一批次的大鼠，將其造模成功后納入，以保證每組實驗動物的數(shù)量不變。

1.2.2 給藥方法 造模成功后第2天開始，模型組、假手術(shù)組均予生理鹽水1 mL/(100 g·d)灌胃；多巴絲肼組予多巴絲肼200 mg/(kg·d)灌胃；針?biāo)幗Y(jié)合組予補腎止顫方1 mL/(100 g·d)灌胃，并結(jié)合埋針療法。各組大鼠均予隔天治療(每周一、周三、周五)，連續(xù)治療3周。每組最后均為10只大鼠。

1.2.3 埋針治療處方 肝俞、腎俞、百會、舞蹈震顫區(qū)，取穴參照華興邦的《大鼠穴位圖譜的研制》[9]。

1.2.4 標(biāo)本采集與制備 各組大鼠治療3周后，采集大鼠腦組織標(biāo)本，參照文獻[4]對大鼠腦組織進行包埋、切割。接著分離黑質(zhì)所在的部位(在出現(xiàn)海馬連接處切面的腹側(cè)面即開始出現(xiàn)黑質(zhì)，至橋橫纖維出現(xiàn)處黑質(zhì)基本消失)。將前囟后4～7 mm的中腦黑質(zhì)所在的腦部冠狀切片組織提取出來，在光學(xué)顯微鏡下把黑質(zhì)組織分離出來，并提取4個部分的黑質(zhì)組織，制備成勻漿，檢測實驗指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 一般狀況與行為學(xué)的檢測 用藥期間每日觀察并記錄各組大鼠的一般狀況，治療3周后，進行行為學(xué)檢測。

1.3.2 中腦黑質(zhì)區(qū)GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性檢測 依據(jù)南京建成生物工程研究所提供的GSH、LPO、GSH-Px、SOD測試盒操作說明使用分光光度法測定中腦黑質(zhì)區(qū)中GSH、LPO的含量及GSH-Px、SOD活性。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 注射蛋白酶抑制因子第2周，造模組大鼠表現(xiàn)為活動減少，毛色逐漸發(fā)黃，精神萎靡，自主活動及進食情況明顯減少，動作遲緩，被抓時反抗動作減少。在第2周的注射結(jié)束后，造模組大鼠活動較前更少，僅見其偶爾拖著腳轉(zhuǎn)動幾下，且其尾巴和四肢明顯僵硬，軀體和四肢呈現(xiàn)卷曲姿態(tài)，行走時重心明顯降低，在伸展姿態(tài)時腹部接觸地面，拖步行走，起身覓食的時候，前爪出現(xiàn)震顫。直至4周造模時間結(jié)束，造模組大鼠均出現(xiàn)持續(xù)運動遲緩，行走時四肢和軀體的伸展緩慢，個別大鼠出現(xiàn)驚厥甚至死亡現(xiàn)象(死亡大鼠2只)。而假手術(shù)組大鼠皮毛光滑，活潑好動，飲食如常，體重增長。為保證實驗動物每組數(shù)量不變，死亡的2只大鼠以同批次實驗大鼠予補充入組，補充的大鼠均造模成功。

治療后，假手術(shù)組大鼠皮毛光滑，活潑好動，飲食如常。模型組大鼠的一般狀況與造模成功時的表現(xiàn)大致相同。多巴絲肼組大鼠毛色、飲食均逐漸有所恢復(fù)，活動有所增多，但較假手術(shù)組仍差，前爪震顫、尾巴四肢僵硬等癥狀較模型組均明顯減輕。針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠皮毛、活動、飲食等方面逐漸恢復(fù)，但較假手術(shù)組大鼠相比略差。

2.2 行為學(xué)檢測結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的網(wǎng)格試驗和平衡桿試驗移動潛伏期及過桿時間均顯著延長(P<0.01)；與模型組比較，多巴絲肼組和針?biāo)幗Y(jié)合組網(wǎng)格試驗及平衡桿試驗移動潛伏期和過桿時間均明顯縮短(P<0.01)；而針?biāo)幗Y(jié)合組與多巴絲肼組比較，各移動潛伏期及過桿時間均顯著縮短(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果(±s) s

模型組與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；多巴絲肼組、針?biāo)幗Y(jié)合組與模型組比較，2)P<0.01；針?biāo)幗Y(jié)合組與多巴絲肼組比較，3)P<0.05

2.3 GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性 與假手術(shù)組相比較，模型組GSH含量和GSH-Px、SOD活性均明顯降低(P<0.01)；與模型組相比較，多巴絲肼組和針?biāo)幗Y(jié)合組GSH含量和GSH-Px、SOD活性均明顯升高(P<0.01)，且針?biāo)幗Y(jié)合組較多巴絲肼組升高明顯(P<0.05)。與假手術(shù)組相比較，模型組LPO含量顯著升高(P<0.01)；與模型組相比較，多巴絲肼組和針?biāo)幗Y(jié)合組LPO含量均明顯降低(P<0.01)，且針?biāo)幗Y(jié)合組較多巴絲肼組降低明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組GSH、LPO含量及GSH-Px、SOD活性比較(±s)

模型組與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；多巴絲肼組、針?biāo)幗Y(jié)合組與模型組比較，2)P<0.01；針?biāo)幗Y(jié)合組與多巴絲肼組比較，3)P<0.05

3 討 論

PD當(dāng)歸屬于中醫(yī)學(xué)“顫震”范疇。研究發(fā)現(xiàn)肝腎俱虧是PD的病機關(guān)鍵，據(jù)此本研究提出從肝腎論治PD，補陰以制陽，創(chuàng)制了補腎止顫方[3-4，10]。補腎止顫方由龜鹿二仙膏合大定風(fēng)珠化裁而來。龜鹿二仙膏有生精、益氣、養(yǎng)血、陰陽并補的特點，大定風(fēng)珠具育陰潛陽、柔肝熄風(fēng)功效，配伍山萸肉、黃精、肉蓯蓉滋腎益肝；天麻、鉤藤鎮(zhèn)痙熄風(fēng)止顫，諸藥合用，共奏滋養(yǎng)肝腎、益精填髓、補氣養(yǎng)血、舒筋通絡(luò)、熄風(fēng)止顫之功?，F(xiàn)代藥理研究顯示：龜鹿二仙顆粒可顯著升高衰老模型大鼠血清和組織勻漿中的SOD、GSH-Px活性及顯著降低丙二醛(MDA)含量[11]；大定風(fēng)珠能抗氧自由基，保護神經(jīng)元[12]。相關(guān)臨床觀察顯示，滋補肝腎的中藥可減少左旋多巴藥物的用量，減輕其副作用，改善PD病人帕金森氏病綜合評分量表(UPDRS)評分[13-14]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也提示補腎中藥能改善PD臨床癥狀、延緩PD進展[15-16]。埋針療法的優(yōu)勢在于其對針刺區(qū)的機械性刺激持續(xù)存在并序貫而發(fā)，可產(chǎn)生“經(jīng)絡(luò)后發(fā)感傳效應(yīng)”。埋針療法處方所選取的舞蹈震顫區(qū)是頭針治療PD的特效區(qū)域[17]。

PD黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進行性丟失與自由基清除系統(tǒng)功能降低或失活有關(guān)[18]。研究顯示，在多巴胺能神經(jīng)元變性的過程中氧化應(yīng)激起著重要作用，而PD病人體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)加強，使機體氧自由基產(chǎn)生過多，這是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元凋亡的主要原因[19-21]。腦組織內(nèi)的SOD、GSH-Px、GSH等物質(zhì)均能夠清除自由基[22]。PD大鼠腦組織中GSH含量明顯減少時，機體清除自由基的能力下降，從而引起LPO及其代謝產(chǎn)物MDA生成明顯增多，導(dǎo)致PD大鼠腦組織神經(jīng)元變性死亡[23]。機體清除氧自由基能力的高低間接取決于SOD的活力，GSH-Px可以特異性催化GSH對于H2O2的還原反應(yīng)，故機體清除自由基能力的高低直接取決于GSH-Px的活力[24]。

補腎止顫方聯(lián)合埋針療法能明顯改善PD模型大鼠的行為學(xué)變化，其機制可能是通過提高中腦黑質(zhì)區(qū)內(nèi)GSH含量及GSH-Px、SOD活性，降低LPO的含量，增強中腦黑質(zhì)區(qū)自由基清除能力。