ESR技術應用于逆膠束酶體系性能的研究

彭 馨,徐鵬飛,湯 宇,杜 浩,袁 露,孟 勇

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ESR技術應用于逆膠束酶體系性能的研究

彭 馨*,徐鵬飛,湯 宇,杜 浩,袁 露,孟 勇

(湖南師范大學化學化工學院,石化新材料與資源精細利用國家地方聯合工程實驗室,湖南師范大學化學生物學及中藥分析教育部重點實驗室,有機功能分子組裝與應用湖南省重點實驗室,湖南 長沙 410081)

采用鼠李糖脂構建逆膠束體系,并利用電子自旋共振(ESR)技術研究了鼠李糖脂逆膠束及鼠李糖脂逆膠束酶體系的性能.采用ESR光譜技術計算得出逆膠束體系中超精細分裂常數變化,研究表明鼠李糖脂在正己烷中的臨界膠度為0.07mmol/L.通過分析ESR光譜中旋轉相關時間的變化,探究電子自旋探針在逆膠束中運動受阻和翻轉所需時間的情況同時,ESR光譜的峰值體現了樣品中自由基含量的多少.通過對比逆膠束體系、逆膠束酶體系以及逆膠束酶-苯酚體系的ESR光譜,結果表明鼠李糖脂逆膠束-苯酚體系的自由基最多.通過研究對16-氮氧自由基硬脂酸對兩個體系作用,推測出電子自旋探針自由基團定位于逆膠束水核中,并且推斷電子自旋探針位于水核的邊緣區域,即結合水水層.該研究為逆膠束酶體系的應用提供了堅實的理論基礎.

鼠李糖脂；逆膠束；電子自旋共振；探針；16-氮氧自由基硬脂酸

近年來,逆膠束酶體系性能的研究受到廣泛的關注.目前研究逆膠束酶體系的手段很多,其中應用電子自旋共振法(ESR)研究逆膠束酶體系中各組分締合情況以及酶降解性能是一種非常有效的方法.ESR技術能夠探索物質微觀結構和運動狀態.其研究的原理為:一個未配對電子由低能級到高能級時自旋取向的改變.當順磁性的物質的自旋電子處于外加磁場時,吸收了足夠的電磁輻射后,會發生電子的自旋共振現象.ESR波譜儀能夠檢測出特定的參數,可以通過參數及線性精確地進行分析,獲取不成對電子能態以及所處的位置等信息[1].

采用ESR技術過程中,探針能夠與逆膠束體系接觸,從而檢測逆膠束體系各種性能參數.ESR技術中需要采用氮氧自由基硬脂酸為探針.從ESR光譜中可以求出旋轉相關時間,進而探究逆膠束中各組分的聚合狀態,越大說明探針分子的運動受阻,表明微粘度越大.同時,還能夠從ESR光譜中求出超精細分裂常數N,可以表征探針所處位置的極性大小,N值越大微極性越大.其值對于所處的環境非常敏感,當達到表面活性劑的臨界膠束濃度時,超精細分裂常數會降低,自旋探針從一個強極性的連續相轉變到較小極性的膠束表面.ESR光譜的序參數與超精細分裂常數N類似,序參數越大,探針分子運動越慢.ESR光譜中的信號強度代表在共振條件下樣品所吸收的總能量,即信號強度與樣品中的自由基含量數目成正比[2-10].

目前,ESR技術在檢測蛋白質結構、自由基和光敏催化反應中的應用已經得到了驗證.逆膠束酶體系是一種油包水的結構,酶分子處于水核中.探究逆膠束酶體系的微觀性能在逆膠束酶體系的應用中起著至關重要的作用.本研究采用生物表面活性劑鼠李糖脂單糖脂(RL)構建逆膠束體系,采用16-氮氧自由基硬脂酸(16-DSA)作為探針,研究逆膠束辣根過氧化物酶(HRP)體系的微觀性能.對逆膠束酶體系的微觀結構進行深入研究中降解污染物的研究做了準備工作.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 探針:16-氮氧自由基硬脂酸,購自sigma公司;辣根過氧化物酶,購自sigma公司;鼠李糖脂單糖脂,實驗室自制.正己烷,氯仿,苯酚均為分析純.

1.1.2 儀器 水浴恒溫振蕩器(WHY-2);超聲波清洗儀;pH計(PHS-2F,上海雷磁儀器廠);HZQ-C空氣浴振蕩培養箱;Bruker EMX-EPR型電子自旋共振儀.

1.2 方法

1.2.1 逆膠束酶體系制備 按一定比例將RL與溶劑正己烷混合,將一定濃度的辣根過氧化物酶溶于水中,混合均勻后注入有機相中.放入震蕩器中充分震蕩10h左右之后靜置24h.

1.2.2 ESR樣品制備 將一定量的16-DSA溶于氯仿中,混合均勻形成0.4mmol/L的溶液.將探針與逆膠束酶體系混合至試管中,室溫條件下在搖床中震蕩10h之后,采用25?C水溫進行水浴24h.再將樣品注入樣品管中測定ESR光譜.

1.2.3 ESR中參數計算 (1)超精細分裂常數的計算 超精細分裂常數N的計算方法根據探針的不同而不同.由于本章節實驗采用的探針為16-DSA,超精細分裂常數的算法即為ESR光譜中兩個最值之間距離的二分之一[11],即N為低場峰到高場峰距離的1/2.對3組平行實驗進行計算.

(2)旋轉相關時間的計算

旋轉相關時間的計算如下式[11]:

(2)

當<3ns時,采用式(2).

式中:△為中央峰譜線寬度;h為中央峰高度;+1為低場峰高度;-1為高場峰高度.

2 結果與討論

2.1 不同RL濃度逆膠束ESR分析

考察不同RL濃度對超精細分裂常數的影響,其影響曲線如圖1所示.設置RL濃度從0.03mmol/L逐漸升高至0.07mmol/L.當濃度從0.03mmol/L升高到0.05mmol/L時,N的值保持穩定.當濃度繼續上升,N值突然明顯上升,而當濃度升至0.07mmol/L時,N值開始下降.因此可以推測出0.07mmol/L是RL在正己烷中的臨界膠束濃度.

RL濃度對旋轉相關時間的影響如圖2(A)所示.從整體上看,當RL濃度從0.03mmol/L升高至0.07mmol/L時,旋轉相關時間有下降的現象,說明逆膠束體系微粘度整體上是下降的.從結果可以看出,當表面活性劑濃度高于CMC時,旋轉相關時間有所下降.據相關文獻中報道,X-DSA可能分布在膠束的水核中[12-15].

縱觀RL濃度對超精細分裂常數和旋轉相關時間的影響,當RL濃度為0.05 ~0.07mmol/L時,兩者作用曲線趨勢比較一致,都體現了類似的不穩定性.這可能是由于此時RL的濃度接近于臨界膠束濃度[1].

圖1 RL濃度對超精細分裂常數影響

RL濃度對ESR光譜峰值的影響如圖2(B)所示.整體上看,峰值首先隨著RL的升高而降低,然后升高.從圖中可以看出,當濃度為臨界膠束濃度時,峰值達到最高,此時樣品能量最高.然而當RL濃度為0.08mmol/L時,光譜峰值突然大幅度降低,跟AN變化類似,這是由于體系此時的微極性降低,同時能量也有所降低.

圖2 RL濃度對旋轉相關時間的影響

表1 RL體系中微環境參數

RL體系中微環境參數如表1所示.從表中可以看出,當濃度小于臨界膠束濃度時,3個峰的高度在一定范圍內波動,當濃度在0.05~0.07mmol/L之間時,3個峰的高度均隨著濃度升高而增大;當濃度為臨界膠束濃度時,0和-1均達到最大值,+1接近峰值;當濃度大于臨界膠束濃度時,隨著濃度升高3個峰的高度均呈現出在一定范圍上的減小.

2.2 不同含水量逆膠束ESR分析

RL逆膠束體系旋轉相關時間隨著含水量變化如圖3(A)所示.整體趨勢為先升高再降低.當水與正己烷的體積比為0.4%時,旋轉相關時間最長,表明此時16-DSA分子運動受到的阻力最大[10].同時,在此時探針16-DSA分子與表面活性劑也產生一定的締合作用[9].

而當水與正己烷的體積比從0.6%增加到1.0%時,旋轉相關時間稍有下降趨勢,表明體系的能量達到一個比較平衡的狀態.并且隨著含水量的增加,RL分子鏈變得疏松,即逆膠束個體變大,探針運動的范圍有所增加.從實驗結果來看,探針16-DSA在RL逆膠束體系中翻轉運動受到的阻力較小,這可能是由于RL逆膠束中水核具有較強的超活性,使得探針在其中運動阻力非常小.

圖3 含水量對旋轉相關時間的影響

RL體系含水量對峰值的影響如圖3(B)所示.由圖中所示,隨著含水量的增加,ESR峰值變化的規律性總體上是下降的.當含水量為0.4%時,ESR峰值達到最高.ESR峰值變化與旋轉相關時間變化大體上較為一致.由于含水量增加,逆膠束水核變大,因此水核中結合水部分水層變厚,所以探針運動空間增大,受到的阻力減小,導致旋轉相關時間降低,能量降低.

2.3 不同酶濃度ESR分析

實驗中HRP在RL逆膠束水核中的濃度范圍為0.1~0.5mmol/L,其濃度對旋轉相關時間的影響如圖4(A)所示.

不同HRP濃度對ESR峰值的影響如圖4(B)所示.從圖中來看,總體上峰值隨HRP濃度的變化是先上升再下降的.當HRP濃度為0.1和0.2mmol/L時,ESR峰值均相對較低;當濃度升高至0.4mmol/L時,峰值明顯的升高,而之后稍微有所下降.從結果中可以看出,ESR峰值變化與旋轉相關時間隨著HRP濃度的變化規律并不一致,這是由于ESR檢測中各個參數的變化受很多因素的影響,各個參數之間有一定的聯系但并不完全相互依賴.RL體系中當HRP濃度為0.4mmol/L時能量最大.

圖4 HRP濃度對旋轉相關時間的影響

當HRP濃度在0.1~0.3mmol/L之間時,旋轉相關時間長短較為接近,分別為1.7127ns,1.7545ns和1.6955ns.而當HRP濃度繼續升高,旋轉相關時間有明顯下降.說明此時探針分子運動受到的阻力突然降低,體系的微粘度降低.類似地,當HRP濃度為0.4和0.5mmol/L時,旋轉相關時間也比較類似.在RL體系中,探針仍然處于水核中的結合水中,HRP集中在中心的自由水中[16-17].

2.4 探針定位分析

圖5 探針與酶在逆膠束水核中分布情況

逆膠束水核中的水分為兩類,第一類是自由水,分布在水核的中心部位;第二類為結合水,分布在水核外圍,緊貼表面活性劑[16-17].由結果來看,HRP分子聚集在逆膠束的自由水中,而進入逆膠束水核的探針處于結合水中,探針與酶在逆膠束的分布情況如圖5所示.當越來越多的HRP分子進入水核中心時,由于位于自由水中,HRP分子傾向于相互之間聚集,連接緊密,“團簇”在一起.因此對于位于結合水中的探針來說,受到更小的阻力,因此旋轉相關時間在高濃度HRP時有所降低.

2.5 不同負載狀態下逆膠束的ESR光譜分析

圖6展示了RL逆膠束-酶ESR光譜、RL逆膠束-苯酚ESR光譜和RL逆膠束-酶-苯酚ESR光譜.不同體系光譜不同特征將對于逆膠束體系性能特性有重要指示作用.從圖6中可以得知,RL逆膠束-酶的ESR光譜的信號強度最弱,而RL逆膠束-苯酚ESR光譜的信號強度最強,說明該體系中自由基數量最多,鼠李糖脂分子與苯酚分子之間發生碰撞頻率較高.而RL逆膠束-酶-苯酚的光譜強度居中.

圖6 不同負載的逆膠束ESR光譜

RL-H:RL逆膠束-HRP體系;RL-P:RL逆膠束-苯酚體系;RL-H-P:RL逆膠束-HRP-苯酚體系

3 結語

研究采用電子自旋共振ESR技術研究了鼠李糖脂RL逆膠束酶體系的性能.采用ESR光譜技術計算得出超精細分裂常數變化,RL在正己烷中的臨界膠束濃度為0.07mmol/L.通過分析ESR光譜中旋轉相關時間的變化,得出探針在逆膠束中運動受阻和翻轉所需時間的情況.同時,ESR光譜的峰值體現了樣品中自由基含量的多少.通過旋轉相關時間的比較,推測出辣根過氧化物酶主要存在于逆膠束體系中的自由水中.通過對旋轉相關時間和能量的對比,推測出在逆膠束體系中辣根過氧化酶的濃度為0.4mmol/L的酶活最高.通過對比逆膠束體系、逆膠束酶體系以及逆膠束酶-苯酚體系的ESR光譜,RL逆膠束-苯酚體系的自由基最多.通過研究對16-DSA對兩個體系作用,推測出探針自由基團定位于逆膠束水核中,并且推斷探針位于水核的邊緣區域,即結合水水層.

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Study of enzyme-reverse micelle systembyelectron spin resonance.

PENG Xin*, XU Peng-fei, DU Hao, TANG Yu, YUAN Lu, MENG Yong

(National & Local Joint Engineering Laboratory for New Petro-chemical Materials and Fine Utilization of Resources; Key Laboratory of Chemical Biology and Traditional Chinese Medicine Research (Hunan Normal University), Ministry of Education; Key Laboratory of the Assembly and Application of Organic Functional Molecules of Hunan Province；College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)., 2019,39(2)：818~822

In this study, a reverse micelle system was constructed using rhamnolipid, and the properties of rhamnolipid reverse micelles and rhamnolipid reverse micelle enzyme system were studied by electron spin resonance (ESR) technique. ESR spectroscopy was used to calculate the performance. The ultrafine splitting constant in the reverse micelle system was obtained. The study showed that the criticality of rhamnolipid in n-hexane was 0.07mmol/L. By analyzing the change of rotation correlation time in ESR spectrum, the electron spin probe was explored. At the same time, the peak of the ESR spectrum reflects the amount of free radicals in the sample. By comparing the reverse micelle system, the reverse micelle enzyme system and the reverse micelle enzyme-phenol system ESR spectra showed that the rhamnolipid reversed micelle-phenol system had the most free radicals. By studying the effect of 16-nitroxyl radical stearic acid on two systems, it was speculated that the electron spin probe free radicals were localized. In the reverse micelle water core, and inferred that the electron spin probe was located in the edge region of the water core, that was, the water-water layer was combined. This study provided a solid theoretical basis for the application of the reverse micelle enzyme system.

rhamnolipid；reversed micelle；electron spin resonance；probe；16-nitroxyl radical stearic acid

X132

A

1000-6923(2019)02-0818-05

彭 馨(1987-),女,內蒙古烏海人,講師,博士,主要從事資源循環方面研究.發表論文20余篇.

2018-07-06

國家自然科學基金資助項目(51608194);湖南師范大學化學生物學及中藥分析教育部重點實驗開放基金資助項目(KLCBTCMR18-12)

* 責任作者, 講師, xinp@hunnu.edu.cn