腦缺血再灌注損傷中關鍵蛋白的研究進展

孟文靜，陳真

(中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198)

腦血管疾病是一種常見的臨床疾病，其中以腦缺血性卒中最為常見，缺血性卒中是世界上導致死亡的第三大原因，其并發癥包括偏癱，昏迷甚至死亡。恢復缺血區域的腦灌注并盡快挽救缺血半影中的神經元是腦梗死治療的核心問題。然而，供應給缺血區域血液的恢復也可能誘發進一步的組織損傷和功能障礙，這被稱為缺血再灌注(I/R)損傷[1]。研究表明，72%的缺血再灌注損傷是由再灌注損傷引起的，在幾種動物缺血性中風模型中，缺血后長時間再灌注可導致比永久性血管結扎更嚴重的腦梗死[2]。因此，減少腦I/R損傷已成為缺血性腦血管病治療的關鍵。

目前研究腦缺血再灌注損傷的機制尚未完全明確，但可以確定的是與自由基生成，腦能量衰竭，腦血屏障(BBB)損傷，炎癥和細胞凋亡有關。相對應的一些興奮性氨基酸調控藥物、自由基清除劑、神經營養因子、鈣離子拮抗劑、一氧化氮合酶抑制劑、抗凋亡藥物在臨床得到廣泛研究和應用。因此尋找腦缺血再灌注中的關鍵蛋白，研發靶點藥物已成為治療缺血性腦損傷的關鍵一步。

1 Notch1信號通路

Notch基因于1917年由托馬斯·亨特·摩根(Thomas Hunt Morgan)發現，是一種普遍存在的信號通路，在小鼠和人類中，存在4種Notch受體和5種Delta/Serrate/Lag2(DSL)配體，其被稱為Jag1和Jag2和Delta樣(Dll)，Dll3和Dll4。該通路通過直接細胞-細胞相互作用激活，促進信號細胞上Notch配體(Dll1、Dll3、Dll4、Jagged-1和Jagged-2)與相應細胞上的Notch受體之間的結合。配體結合后，Notch被γ-分泌酶和腫瘤壞死因子α(TNF-α)切割以釋放受體細胞內結構域(NICD)，其易位至細胞核并與轉錄因子結合，通過調節細胞間接觸依賴性通訊、細胞分化、增殖和凋亡參與許多關鍵生理學和病理過程[3]。

該途徑除在胚胎發育有重要作用外，在脊椎動物和無脊椎動物的成熟大腦中也顯示出關鍵功能，包括神經祖細胞調節，神經元連接，突觸可塑性和學習記憶。Notch信號傳導抑制許多生物體中的神經分化，抑制少突膠質細胞發育并刺激神經膠質細胞的分化。Notch也是發育階段神經干細胞維持和自我更新的關鍵調節因子，在神經退行性疾病中受到異常調節[4]，是發育階段神經干細胞維持和自我更新的關鍵調節因子[5]，在神經祖細胞分化和中樞神經系統損傷后的炎癥反應中起重要作用。

研究表明，缺血/缺氧預處理可以增強缺氧誘導因子-1(HIF-1)和血管內皮生長因子(VEGF)的表達，而VEGF是Notch1信號通路的上游[6]。Guan等[7]在研究中，建立了大腦中動脈閉塞/再灌注(MCAO/R)大鼠模型，發現MCAO/R可引起腦梗死，海馬神經元損傷和細胞凋亡，并激活Notch1信號通路。Shi等[8]的研究表明，miR-137通過靶向Notch1來調節Notch信號通路以保護神經元免受OGD / R誘導的細胞損傷。Yan等[9]的研究發現天然香豆素衍生物蛇床子素(Ost)上調基因Notch 1和Hes 1的表達，當Notch活性被γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷時，Notch 1和Hes 1 mRNA的表達下調。因此，在腦缺血治療研究中，Notch信號轉導通路可作為重要靶點。

2 PI3K/AKT/GSK-3β信號通路

Akt是一種57kDa的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途徑的主要已知效應物。其以低活性形式位于細胞質中，當細胞被細胞外信號(例如缺血或缺氧)刺激時，Akt的C末端Ser 473殘基被磷酸化激活以調節上游分子，參與涉及許多生物過程的多種信號傳導途徑，包括細胞存活、凋亡、增殖和分化。PI3K/Akt信號傳導途徑是將細胞膜受體信號轉導入細胞內信號的重要模式，近年來，PI3K/Akt細胞存活信號通路在腦損傷領域得到越來越多的研究，該途徑的激活在炎癥、血栓形成和血管通透性方面具有抑制作用，從而產生保護血管功能。Akt在缺氧缺血后作為腦中的存活激酶，通過磷酸化其底物以防止炎癥和細胞凋亡而起到存活激酶的作用。許多化合物(如生長因子、雌激素、自由基清除劑和其他神經保護劑)通過上調p-Akt來減少缺血性損傷。研究證實，PI3K/Akt信號通路也是參與腦內神經元凋亡的主要途徑之一[10]。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是由兩種同種型GSK-3α和GSK-3β組成的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Akt最重要的下游靶標之一就是GSK-3β，GSK-3β中第9位絲氨酸的磷酸化抑制GSK-3β的活性。在神經元中，GSK3β參與神經元微管動力學，并通過磷酸化其下游靶標來調節未成熟神經突的延伸和回縮，在細胞增殖、分化、運動、凋亡和炎癥方面有重要作用。而活化的Akt通過與GSK-3β結合，誘導GSK-3β易位至細胞膜，使N-末端Ser活性位點磷酸化，從而使GSK-3β失活，抑制GSK-3β活性[11]。GSK3β活性的增加與神經元凋亡的增加相關，并且GSK3β活性的增加先于細胞凋亡的誘導，添加抑制性GSK3β結合蛋白或失活形式的GSK3β可降低凋亡水平[12]。

Zhang等[13]的研究發現山柰酚(KF)的心臟保護是通過對Akt/GSK-3β信號傳導途徑的調節發揮作用的。Wang等[14]在研究一種人參皂苷(HN)的變體HNG時，發現其治療改善了小鼠實驗性ICH后的功能和形態學結果，并且與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制細胞凋亡有關。PI3K/AKT/GSK-3β信號通路可作為腦缺血治療研究中一重要通路。

3 PI3K/AKT/mTOR信號通路

mTOR是雷帕霉素在哺乳動物細胞中的分子靶標，是一種進化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。mTOR蛋白以兩種形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTOR是細胞生長和代謝的關鍵調節因子，增加mTOR活性可減弱自噬并恢復細胞中溶酶體的完整性。磷酸化形式的Akt和mTOR在PI3K/Akt/mTOR途徑的細胞保護中起主要作用，激活PI3K/Akt/mTOR可促進中樞神經系統(CNS)損傷后的神經保護作用[15]。

有證據表明，阻斷PI3K/AKT/mTOR信號通路可能是誘導細胞凋亡和抑制增殖的關鍵途徑[16]。PI3K/Akt/mTOR信號通路參與機械損傷后神經元的凋亡，并可通過線粒體途徑誘導細胞凋亡，同時PI3K/Akt/mTOR信號傳導途徑與自噬的起始密切相關。 Akt的下游磷酸化可以激活TSC1/2，其進一步促進mTOR活化。mTOR通過抑制下游分子復合物ULK1來負調節自噬水平。

Pan等[17]發現黃角顆粒對大鼠腦缺血再灌注損傷模型的保護作用可能與PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活有關，其對模型組大鼠腦組織IL-10、PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達均有明顯的上調作用，IL-1β和TNF-α在腦組織中的表達明顯增強。Li等[18]研究發現雷公藤內酯(TP)也通過PI3K/Akt/mTOR通路產生神經保護作用。

4 JAK2/STAT3

信號轉導和轉錄激活因子(STAT)蛋白包含在細胞質中的轉錄因子家族之中，其參與細胞因子，生長因子和激素信號傳導之后的分化、增殖、存活、凋亡和血管生成。 STATs由酪氨酸磷酸化激活，酪氨酸磷酸化通常是瞬時并且緊密調節過程。STAT可根據其特定功能分為兩組：一種由STAT2、STAT4和STAT6組成，它們被少量細胞因子激活，并在T細胞發育和γ-干擾素(IFNγ)信號傳導中發揮作用。另一組包括STAT1、STAT3和STAT5，它們通過一系列配體在不同組織中激活，并參與IFN信號傳導、乳腺發育和胚胎發生，在控制細胞周期進程和細胞凋亡中也起重要作用，受體相關酪氨酸激酶JAK家族由4個成員組成：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2，它們以受體二聚化或寡聚化的方式以部分特異性方式激活。STAT3被磷酸化-JAK2(pJAK2)磷酸化并隨后轉移至細胞核，在細胞核通過與含有γ-激活序列的基因的啟動子區域結合來調節其靶基因的轉錄。JAK/STAT信號通路還可以調節癌細胞的生物學特性，如增殖、生長、分化、遷移和侵襲[19]。研究表明，JAK2 /STAT3信號通路在氧化應激損傷的細胞和動物模型中被激活[20]，一旦發生缺血性卒中，p-STAT3的表達顯著增加。

多項研究表明，激活JAK2/STAT3信號通路對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用[21-23]。Hou等[24]研究還發現白藜蘆醇可以通過激活JAK2/STAT3間接上調PI3K/AKT/mTOR通路，增加BCL-2的表達但降低缺血/再灌注時BAX和切割的caspase-3表達，減少TUNEL陽性細胞的數量。銀杏內酯(GK)通過JAK2/STAT3途徑增加HIF-1α/VEGF的表達促進缺血性腦卒中后血管新生[25]。

5 TLR4/NF-κB信號通路

小膠質細胞被認為是腦組織中的主要免疫效應細胞，而免疫系統中主要的受體類型是Toll樣受體(TLRs)。Toll樣受體(TLRs)是跨膜蛋白的一員，是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，是哺乳動物中唯一將細胞外抗原信息轉導入細胞并引發炎癥反應的分子。所有TLR中，Toll樣受體4(TLR4)是TLR中首個被發現的，它是一種富含亮氨酸的跨膜蛋白，通過識別和結合多種內源和外源配體在免疫防御和免疫調節中發揮作用，TLR4通過膜轉導這些信號，隨后調節其表達。TLR4刺激絲裂原活化蛋白(MAP)和應激激酶，如細胞外調節激酶(ERK)1/2，p38和Jun激酶(JNK)1/2，進而激活核內炎癥的轉錄調節因子[26]。

研究表明，在缺血或缺血再灌注損傷后，腎小管上皮細胞和腎臟白細胞中發現TLR4的上調[27]。TLR4也在肝臟、肺臟和心臟的缺血再灌注炎癥損傷中起作用，并在腦缺血再灌注中誘導細胞凋亡。TLR的激活通常導致NF-κB的核轉位，NF-κB是一種廣泛使用的轉錄因子，可以特異性結合許多基因的啟動子和增強子，從而參與多種細胞功能，如炎癥、免疫反應、血液生成、細胞增殖和凋亡。NF-κB活化導致表達不同的促炎細胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-8，因此抑制腦NF-κB活化與神經保護作用相關。TLR4信號通路的下調或表達下調可能在缺血模型中發揮保護作用。

Han等[28]通過建立MCAO模型，發現針刺可以通過抑制小膠質細胞中的TLR4/NF-κB信號通路來調節MCAO大鼠的炎癥反應。Zhang等[29]發現，N-丁基苯酞(NBP)其通過TLR4/NF-κB抑促炎細胞因子的表達，包括IL-6、IL-1β和TNF-α，從而在阿爾茨海默病和中風動物模型中具有潛在的神經保護作用。同樣的，Liu等[30-31]研究表明，抑制TLR4/NF-κB信號通路可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。

6 JNK

神經細胞死亡機制的重要組成部分是激酶的混合譜系激酶(MLK)家族，其激活信號轉導途徑至神經元細胞死亡。MLK3是MLK家族的成員，MLK3磷酸化并激活MAPKK，包括MKK4和MKK7，其反過來激活JNK的Thr-183和Tyr-185殘基，體外研究表明，MKK4可以激活JNK和p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)[32]。腦卒中時神經細胞凋亡在腦I/R損傷誘導細胞死亡中起重要作用，在缺血和再灌注損傷中，自由基通過靶向多種細胞信號傳導途徑也在缺血性腦損傷的發病機理中起重要作用。C-JNK作為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成員，有助于細胞凋亡。如抑制JNK/AP-1途徑顯示改善新生兒缺氧缺血性腦損傷[33]。

JNK家族有3種亞型，包括JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和JNK2在大多數組織中表達，JNK3選擇性地存在于心臟和大腦中。磷酸化的JNK3激活核中的底物c-Jun，活性c-Jun可誘導凋亡蛋白的表達，在凋亡細胞的死亡中起關鍵作用。腦缺血/再灌注促進谷氨酸受體介導的JNK3信號傳導途徑的激活。JNK參與許多疾病的發病機制，例如中風，動脈粥樣硬化，阿爾茨海默氏癥和帕金森病，在炎癥、細胞凋亡和壞死的信號通路中發揮重要作用，并調節缺血和再灌注過程中神經元和心肌細胞損傷中涉及的幾個轉錄和非轉錄過程[33]。研究發現，JNK磷酸化和JNK依賴性通路激活在大鼠和小鼠全腦和局灶性腦缺血后發生，JNK的激活加重了中風的腦損傷，引起炎癥并導致缺血性細胞死亡[34]。缺血再灌注(I/R)可顯著增強海馬CA1區JNK3的磷酸化，導致神經元損傷。Wen等[35]研究發現，研究表明丁基苯酞可顯著增加I/R誘導的腦損傷后CA1錐體神經元的存活并抑制JNK/caspase-3信號通路發揮神經保護作用。Duan等[36]研究表明苦瓜多糖阻止了由腦內出血損傷引起的JNK3、c-Jun和caspase-3的激活，對腦內出血具有神經保護作用。

7 DAPK1

死亡相關蛋白激酶(DAPK)是一種介導細胞死亡的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有獨特的多結構域結構，包含激酶結構域，鈣調蛋白調節區段，8個錨蛋白重復序列，細胞骨架結合區域和死亡結構域，其在腦缺血后mRNA水平增加。DAPK在正常腦組織中是無活性的，其處于磷酸化狀態并且伴隨于體內缺血而快速且持續地去磷酸化和活化。DAPK在腦缺血后被去磷酸化并被激活。這種活化可以通過磷酸酶鈣調神經磷酸酶的抑制劑FK506或原代皮層神經元中的選擇性NMDA受體拮抗劑MK-801來抑制。其在神經元發育以及損傷恢復中起作用，在受影響的海馬半球的上調。在發育中和成人中樞神經系統中，DAPK1 mRNA在大腦皮層和海馬內的增殖區廣泛表達。此外，DAPK1主要參與神經元發育和損傷恢復過程，它的活性隨著缺氧缺血而增加。

細胞培養模型已證明DAPK參與神經細胞凋亡，神經元損傷后DAPK表達增加，在腦缺血動物模型中的組織損傷區域中mRNA水平增加[37]。DAPK的小分子抑制劑烷基化3-氨基-6-苯基噠嗪顯著減輕缺血性中風后的腦損傷，抑制DAPK去磷酸化有助于缺血小鼠模型的神經保護作用[38]。Pei等[39]研究發現，DAPK1直接磷酸化Ser262上的Tau蛋白，導致中風后皮層神經元的脊柱損傷，小鼠中DAPK1激酶結構域(KD)的遺傳缺失(DAPK1-KD(-/-))或阻斷DAPK1-Tau相互作用可保護脊柱損傷并改善針對中風損傷的神經功能。

8 NLRP3炎性體蛋白

近年來對核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(NLR)的研究越來越多，包括NLRP3、NLRP1、NLRC4和AIM2。其中，NLRP3作為先天免疫中重要的模式識別受體，因參與缺血后的炎癥反應而受到關注。NLRP3炎性體主要在免疫器官和免疫細胞中表達，是細胞中的多蛋白復合物，具有NLRP3、caspase-1和凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)3個結構域作為核心蛋白。其主要功能是識別外源性感染和各種致病微生物內傷的風險信號，介導caspase-1的活化，將pro-IL-β加工成熟的活性形式，在細胞外分泌，從而激活天然免疫反應，導致多級炎癥反應和細胞凋亡。有研究表明，過度炎癥反應在腦缺血的發病機制中起著重要作用，因此，靶向炎癥可能是預防和治療腦損傷的重要治療策略。NLRP3在受氧-葡萄糖剝奪(OGD)或模擬缺血再灌注(I/R)的原代皮層神經元中的表達。I/R損傷可以誘導腦I/R小鼠和中風患者的同側腦組織中NLRP3炎性體蛋白，IL-1β和IL-18的表達增加。

Yu等[40]發現蘿卜硫素通過抑制NLRP3炎性體激活而對腦缺血再灌注損傷發揮神經保護作用。同時，NLRP3的有效調節或抑制有助于預防或治療缺血性中風或糖尿病。Hong等[41]用NLRP3特異性抑制劑，改善了腦缺血再灌注損傷的糖尿病小鼠。因此抑制NLRP3可以預防腦缺血再灌注損傷，NLRP3炎性體可能成為治療缺血性中風的潛在藥物靶標。

9 總結

由腦缺血再灌注引起的腦損傷死亡率在逐年上升，而腦缺血再灌注損傷是一個復雜的、多種通路參與的過程，目前用于治療缺血性腦損傷的主要治療方法旨在實現再灌注，神經保護和神經恢復，因此找到合適的靶點蛋白進行研究是當前國內外學者的研究熱點。本文通過對近幾年研究熱點的靶蛋白進行綜述，以期為腦缺血再灌注損傷提供系統的研究思路。