膠質瘤干細胞在腫瘤微環境中代謝調控的研究進展

許智星，陳 希，李炫辰，柯 雨，劉旭杰，田錦濤，蒲 軍

(昆明醫科大學第二附屬醫院神經外科，昆明 650101)

2016年世界衛生組織將膠質瘤的分子和組織學特征整合起來形成新的分類，即彌漫性膠質瘤和非彌漫性膠質瘤，前者包括由異檸檬酸脫氫酶突變和染色體1p/19q編碼的星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突星形細胞瘤和膠質母細胞瘤，后者包括毛細胞性星形細胞瘤、多形性黃色星形細胞瘤、室管膜下巨細胞性星形細胞瘤[1]。目前的治療主要手段是致力于實現最大化的手術切除，同時使用替莫唑胺化療和放療。自1965年起，治療進展甚微，復發率高，對放化療耐受性強，中位總生存率僅12～15個月，5年生存率僅為5%[2-3]。近年來研究發現，膠質瘤干細胞(glioma stem cells，GSCs)在微環境中能通過調控超音速刺猬蛋白-神經膠質瘤相關癌基因同源物1、成纖維細胞生長因子2、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinas B，PI3K/Akt)、細胞外調節蛋白激酶1/2等信號通路促進腫瘤細胞的增殖、侵襲、免疫逃避，推動腫瘤血管形成、復發、異質性的形成以及對術后放化療的高耐受性。現就GSCs及其在微環境間的代謝調控機制進行綜述。

1 GSCs的特點

GSCs是一類具有較強自我更新、無限增殖能力和多向分化潛能的與神經干細胞類似的細胞群，研究表明該腫瘤細胞群可以在用生長因子(如表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子)取代且無血清干細胞培養基中形成神經球，自我更新，并能表達正常的細胞標記，在放化療抵抗和腫瘤復發過程中起關鍵作用[4]。作為膠質瘤的重要起源細胞，GSCs與分化的腫瘤細胞相比具有明顯不同的代謝表型，并且可能容易地根據微環境在糖酵解和氧化代謝之間切換。這也表明，GSCs可以拋開腫瘤自身的代謝特征，更多地依靠自身代謝適應和重編能力進行藏匿或分化。

2 GSCs代謝

GSCs在體外研究證實具有自我更新能力，能分化成多種細胞譜系，形成神經球并表達特定的標志物，如巢蛋白、轉錄因子Sox2、CD133抗原等[5-6]。與大多數癌癥干細胞相同，GSCs在不同的代謝條件下具有很強的可塑性和適應力。如在放療過程中，大多數癌癥細胞在輻射下死亡，而GSCs可以保持不受壓力的影響進入細胞周期，迅速增殖促進腫瘤復發[7]。此外有研究顯示，正常細胞在葡萄糖和氧氣充足的情況下，將大部分發生氧化磷酸化，但在腫瘤干細胞中，即使在氧氣充足的條件下，大部分葡萄糖也會自動從線粒體中轉移，而細胞本身則進入糖酵解途徑，產生乳酸。這種代謝適應可以在提供用于基礎瘤細胞繁殖和生長的必要資源的同時，維持腫瘤自身足夠的平衡性，適應來自細胞內外的各種壓力[8]。

3 GSCs的微環境

GSCs的高適應性和可塑性能幫助其在惡劣條件下生存，同時也提示一個重要的線索，即維持細胞干性、代謝可塑性發揮的必要條件：干細胞微環境。與大多數干細胞相同，GSCs與其所處微環境壁龕之間的關系非常密切。目前，周圍血管壁龕[9]，小動脈周圍壁龕[10-12]，周圍缺氧壁龕[13]，周圍免疫壁龕[14]和細胞外基質壁龕[15]在GSCs中均被證實。每種類型的壁龕都含有特定的細胞類型和蛋白質，這些細胞類型和蛋白質負責特定的分子機制，如在GSC周圍血管壁龕中，GSCs與血管內皮細胞密切相關[16-17]。在小動脈周圍壁龕中，已發現蛋白質如基質衍生因子-1α及其受體C-X-C受體4型位于血管內皮細胞周圍[10-12]。在周圍缺氧的情況下，缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)在干性調節中非常重要，但HIFs的表達在血管周圍壁龕和小動脈周圍壁龕中也非常重要[18-19]。在免疫周圍壁龕中，GSC已被證明能誘導骨髓來源的單核細胞和小膠質細胞分化為腫瘤相關巨噬細胞[19-20]。在細胞外基質壁龕中，已經鑒定出在血管生成過程中起關鍵作用的標志物。每種類型的壁龕都包含細胞、蛋白質和(或)分子機制的類型，這些細胞、蛋白質和(或)分子機制在某些情況下是特定類型的壁龕中所特有的，但可在不同環境條件下在不同的壁龕之間共享[15,21]。

4 微環境中的代謝調控

近年來研究顯示腫瘤微環境不僅通過血管重塑和低氧介導的信號通路促進GSCs保護性壁龕的發展，各壁龕及代謝產物還存在雙向代謝調控過程，如腫瘤干細胞能通過上皮-間質轉化的途徑，從細胞外微環境中獲取丙酮酸鹽、乳酸鹽、谷氨酰胺、丙氨酸和(或)酮體等多種代謝物以保持線粒“燃料”供給[22]。有研究表明腫瘤微環境與腫瘤細胞之間的線粒體DNA存在交換機制，目的是支持已損害或呼吸功能較弱的GSCs，并且增強自我更新能力以及GSCs的治療耐受性[23]。這說明GSCs不僅可以交換或內化新陳代謝的營養物質，還可以內化線粒體的能量生成元素以支持其自身的代謝需求，并通過增加細胞毒性和降低抑制性細胞功能逆轉免疫抑制，實現免疫應答。

4.1能量代謝調控

4.1.1糖代謝 在正常大腦中，星形膠質細胞主要通過糖酵解產能，而神經元依賴于氧化磷酸化[24-25]。與正常細胞相比，即使在氧充足的條件下，GSCs仍主要通過糖酵解產能[8]。一般情況下，有氧糖酵解在生產ATP方面的效率低于氧化磷酸化，因此有學者推測，有氧糖酵解使腫瘤細胞能夠產生其他生物合成途徑的前體[24-25]。在原位腫瘤模型中，13C標記的乙酸鹽和葡萄糖在三羧酸循環中顯示出乙酸鹽利用率更高，表明乙酸鹽是三羧酸循環的主要來源，而來自葡萄糖中的碳則被利用到其他生物合成途徑，同時將葡萄糖轉化為乳酸，以滿足快速增殖腫瘤細胞的能量所需[26]。另一項研究表明，GSCs中的葡萄糖用來維持嘌呤的合成，證實糖代謝可以為其他合成代謝過程提供中間產物和碳源[27]。但Vlashi等[28]根據細胞外酸化率，耗氧量和乳酸產量研究發現，在常氧條件下，GSCs的糖酵解程度低于非GSCs。這兩種不同的研究結果說明GSCs具有改變其代謝特征以適應環境和生存的能力。

葡萄糖轉運蛋白(glucose transporter，GLUT)家族在葡萄糖轉運中具有重要作用，但它們也可以運輸包括果糖、甘露糖、半乳糖和(或)葡糖胺在內的其他底物。已知的GLUT 1,2,3,6,8,10和13均在大腦中表達，其中以GLUT1和GLUT3的表達最為顯著[29-31]。GLUT1對血糖跨血腦屏障的運輸至關重要，GLUT1經缺氧/HIF1-α調節，使缺氧區域內的細胞通過攝取增加的葡萄糖水平而保證自身生存[32]。與GLUT1相比，GLUT3是神經元GLUT且具有增加葡萄糖親和力的作用。GLUT3的調節因子包括HIF和核因子κB，其表達高低與多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)和許多其他實體癌預后相關[32-33]，GSCs可以通過PI3K/Akt途徑，調控GLUT3的表達并促使其向細胞表面轉移以促進有氧糖酵解。研究表明[34]，Akt還將己糖激酶2募集到線粒體，使其依環境不同選擇性進行糖酵解和氧化磷酸化兩種代謝方式，防止細胞凋亡。此外，PI3K和Akt可將葡萄糖中的碳轉運給其他生物合成途徑，敲除GSCs中的GLUT3可降低體外和體內GBM的生長[35-36]。

線粒體是細胞呼吸產生能量的主要場所，膠質瘤研究中已報道過多種線粒體功能障礙的情況，如結構異常、代謝改變、線粒體DNA突變等[37]。有報道指出，多數情況下腫瘤干細胞線粒體DNA水平較低，分化后細胞內DNA復制數量則明顯增加[8]。Xie等[38]也通過細胞周期蛋白依賴性激酶5激活發動蛋白相關蛋白1證實，與非GSCs相比，GSCs中線粒體分裂增加。然而，也有研究表明與分化后細胞內的線粒體相比，雖然腫瘤細胞內的線粒體數量少，但其體積大，質量重，在有效增加線粒體膜電位，增加線粒體活性氧類的同時也增強耗氧率。體積增大的線粒體也被證實與腫瘤干細胞DNA損傷耐受性高度相關[39]。這也說明即使在低氧條件下，腫瘤干細胞也能利用較少的氧氣滿足自身的代謝需求；但這并不意味著GSCs抗氧化能力弱，相反，雖然GSCs中的線粒體具有較高的活性氧類水平，但瘤體細胞內總的活性氧類水平較低，恰恰反映出GSCs能有效利用抗氧化機制，不僅有助于維持GSCs的干性，還能保持對治療高耐藥性；實驗表明即使阻斷線粒體代謝，結果僅迫使其切換至加大糖酵解途徑的效果，仍然具有非常高的代謝可塑性[34]。

4.1.2脂代謝 盡管GSCs中大量研究都集中在糖代謝上，但越來越多的研究表明[40-44]，其通過改變脂肪酸氧化所需酶的表達，參與脂代謝的調控。肉堿棕櫚酰轉移酶1A和肉堿棕櫚酰轉移酶1C分別是長鏈脂肪酸轉運到線粒體和脂肪酸β氧化的調控劑，GSCs可以通過對這兩種酶的調控進而調節瘤體自身的產能[40]。研究表明，肉堿棕櫚酰轉移酶1A和肉堿棕櫚酰轉移酶1C在膠質瘤患者中均高表達，且用肉堿棕櫚酰轉移酶抑制劑作用于GSCs，能降低細胞總數和增殖細胞百分比[41]。此外，GSCs可以上調極長鏈酰基輔酶A合成酶同源物3的表達，將輔酶A添加到脂肪酸中，用于滿足其他代謝途徑的需求，Sun等[42]和Pei等[43]通過實驗證實，酰基輔酶A合成酶同系物3的缺失降低了GSCs中CD133、Sox2的表達，導致膠質瘤異種蛋白在動物模型中不能繁殖成瘤。對于膽固醇，GSCs可以通過調控合成膽固醇所需的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶增強腫瘤細胞對其攝取[44]。

4.1.3氨基酸代謝 在低氧條件下，腫瘤細胞依賴高水平的谷胱甘肽維持氧化還原穩態，以應對氧化還原應激水平的增加，研究表明膠質瘤增加游離氨基酸含量以支持谷胱甘肽生成，還發現蛋白質分解代謝和自噬增加的證據，這與慢性缺氧引起的自噬和蛋白質降解增加情況一致，表明缺氧細胞中谷胱甘肽合成增加[45]；同時，在低氧條件下GSCs依靠其調節谷胱甘肽的能力可能導致GBM細胞對化療和放療更具耐藥性[46]。天冬酰胺是癌細胞凋亡耐藥性的另一種氨基酸。Karpel-Massler等[47]在GBM中使用大腸埃希菌衍生的L-天冬酰胺酶處理GSCs和源自患者的異種移植物，結果顯示GBM模型的子集減少，表明L-天冬酰胺酶可以促進膠質瘤細胞凋亡，然而GSCs可以通過天冬酰胺合成酶的上調獲得對L-天冬酰胺酶的耐藥性。此外，賴氨酸也被認為是癌癥的潛在生物標志物。賴氨酸分解代謝可通過糖蛋白途徑和管道途徑進行，糖蛋白途徑主要用于發育中的大腦，而管道途徑通常用于成年大腦。研究證實GSCs可通過上調賴氨酸分解代謝中間體α-氨基己二酸，繼續通過糖蛋白途徑調控賴氨酸代謝，隨后的檢測也證實，α-氨基己二酸的表達與患者生存率相關[48]。

4.2免疫代謝調控 小膠質細胞和髓源性巨噬細胞代表兩種具有相似免疫調節作用的細胞群，因刺激因素不同，膠質瘤相關的小膠質細胞/巨噬細胞(glioma-associated microglia/macrophages，GAM)既可以活化為促炎作用更強的M1樣表型，也可以活化成以抗炎為主的M2樣表型[49-50]，在膠質瘤組織中，檢測到大量M2相關抗炎因子,如轉化生長因子-β、白細胞介素-6、白細胞介素-10等，僅檢測到少量M1相關促炎因子,如γ干擾素、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-2等[51-52]。研究表明GSCs誘導GAM活化為M2樣表型可促進腫瘤的生長、遷移、侵襲，同時GAM促進細胞外基質的分泌，既能表達VEGF促進新血管生成，還能促進GSCs中壁龕因子的表達，形成有效循環機制，為免疫抑制微環境提供重要幫助[53]。

單核細胞趨化蛋白-1是GAM最主要的化學誘導物之一，單核細胞趨化蛋白-1能促進新生血管生成和調節性T細胞的浸潤，增強腫瘤細胞增殖及侵襲能力，其表達程度與膠質瘤等級相關，而GSCs通過表達單核細胞趨化蛋白-1、VEGF、基質衍生因子-1α等生長因子和化學引物蛋白，將GAM募集到缺氧壁龕中以促進腫瘤發展[52,54-55]。

調節性T細胞是機體最重要的免疫抑制細胞，研究證實能將腫瘤浸潤性T細胞轉移到腫瘤保護性調節性T細胞中誘導免疫抑制表型[56]。白細胞介素-10可通過抑制抗原呈遞細胞、調控T細胞增殖、調節性T細胞等誘導免疫抑制表型[57-59]，而目前研究認為白細胞介素-10主要來源于GAM通過信號轉導和轉錄激活因子3信號通路轉錄形成[58,60]。

GSCs可以去分化形成內皮細胞和周細胞，相關研究表明，約60%的內皮細胞來源于GSCs[61]，血管內皮細胞在膠質瘤中可通過HIF-2α介導精氨酸酶1的表達，激活和促進GAM進入腫瘤，隨后巨噬細胞活化并參與腫瘤的發展[62]。此外，GSCs分泌轉化生長因子-β誘導M2型GAM極化，誘導抗原性調節性T細胞，抑制效應T細胞的增殖，適應免疫反應并強化GSCs的侵襲性[63]。研究證實，幾乎所有GAM都表達膜結合的Fas配體，而凋亡T細胞的特點是Fas受體表達，因此，有學者認為GAM通過Fas-Fas配體相互作用驅動活化T細胞的凋亡，從而進一步增強微環境的免疫抑制[64-65]。有研究顯示，非經典Wnt(Wingless/Int1)通路配體Wnt5a是GSCs體內侵襲能力的關鍵條件因子，能通過調節參與細胞外基質金屬蛋白酶的表達增強膠質瘤細胞的遷移和侵襲[66-68]。Hu等[66]通過轉錄組學和基因組學分析也表明，GSCs利用Pax6/Dlx5轉錄程序調節Wnt5a介導GSCs向內皮相細胞分化，反之，GSCs衍生的內皮樣細胞產生Want5a促進宿主內皮細胞的聚集和增殖，該過程有利于腫瘤周圍衛星病灶的形成，從而產生支持侵襲性膠質瘤生長的壁龕，最終導致腫瘤復發[66,69]。

4.3缺氧代謝調控 缺氧在任何關于代謝重編程和可塑性中均發揮重要作用。研究表明缺氧在體外可以促進神經球形成，并上調某些干細胞基因，如Sox2和Oct4。HIF-1α和HIF-2α是在缺氧環境下最關鍵的兩個因子，HIF-1α可以通過調控PI3K/Akt和細胞外調節蛋白激酶1/2信號通路增加腫瘤代謝，形成更多的神經球，促進腫瘤生長；然而，HIF-1α對于正常的神經干細胞功能也起關鍵作用，因此在這種矛盾的情況下，單純性抑制HIF-1α可能達不到預期的治療效果。HIF-2α則對GSCs功能和細胞“干性”維持更具有特異性。HIF-2α能穩定并增加干細胞特異性因子(如Nanog、Oct4和Sox2)的表達，盡管HIF-1α和HIF-2α在GSCs龕中均有表達，但在GSCs壁龕中HIF-2α的表達優于HIF-1α，HIF-2α可能是更為理想的治療靶點[70-72]。此外，缺氧還促使腫瘤以糖酵解為主要代謝途徑，由于高水平的乳酸產生并分泌到腫瘤空間，大多數腫瘤細胞都處于相對酸性的微環境中，研究顯示腫瘤酸化不僅可以促進GSCs標志物表達和自我更新，同時GSCs通過自身旁分泌還能促進HIF-1α和HIF-2α在干細胞中的進一步表達，隨后的體外實驗顯示，上調pH可影響HIF-2α表達，降低GSCs自我更新能力，說明酸性環境有利于維持腫瘤生長和耐藥性[73]。

5 小 結

膠質瘤微環境是一個決定腫瘤進程的動態環境，雖然一直存在圍繞GSCs假說的爭議，但其與微環境間的相互作用在重塑、構建、促進膠質瘤的發生發展中起重要作用。這也是膠質瘤及其代謝特性的研究應著重基于微環境的前提下進行的原因。一旦將這些聯系分開，關于細胞“干性”維持、代謝特征和信號通路依賴性等研究將不可避免地出現嚴重偏倚。

目前雖然有一套標準化的實驗用于鑒定GSCs，但仍不清楚多個GSCs亞群是否存在不同的周圍血管壁龕，是否具有不同的特征(慢速還是快速循環)以及每步關鍵信號通路如何發揮調控機制。因此，深入研究GSCs及其在微環境中的代謝調控機制具有重要意義，在提供實時有效理論基礎的同時，也能為新治療方案的研究提供新的途徑和思路。