黃芪總苷對H2O2誘導(dǎo)的衰老心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激及PI3K/AKT通路的影響

沈瑩， 柳湘潔， 雷超， 曾永孝， 艾娟， 譚婉燕

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院老年病科，湖北武漢 430077；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北武漢 430077）

心血管疾病的發(fā)病率有逐年增高的趨勢，嚴(yán)重威脅我國老年人群的身心健康[1]。衰老是隨著年齡增加而逐漸出現(xiàn)的生物學(xué)過程，是機(jī)體生理功能出現(xiàn)不可逆的衰退過程[2]。心肌細(xì)胞衰老與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。心肌細(xì)胞的衰老常常伴隨著心肌收縮力下降，心輸出量減少，最終導(dǎo)致心功能障礙、心血管疾病的發(fā)生。大量研究證明，輕微的慢性炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激會導(dǎo)致衰老和心肌細(xì)胞凋亡。中藥黃芪可有效清除自由基，減少氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生，具有抗氧化作用[3，4]，對心肌細(xì)胞可起到保護(hù)作用[5]。然而，其有效成分黃芪總苷對衰老心肌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究采用H2O2刺激誘導(dǎo)大鼠心肌H9C2細(xì)胞衰老模型，探究黃芪總苷對衰老心肌細(xì)胞中與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的PI3K/AKT通路的影響，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞大鼠心肌細(xì)胞H9C2，由美國ATCC公司提供。

1.2藥物與試劑黃芪總苷購于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號：EY-（USP）-0202；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）購于美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧簇（ROS）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；丙二醛（MDA）檢測試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司。兔抗p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、GAPDH購于Abcam中國官網(wǎng)。

1.3儀器SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀（中國上海美谷分子儀器有限公司）；CytoFLEX S流式儀[貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司]。

1.4體外培養(yǎng)大鼠心肌H9C2細(xì)胞將大鼠心肌H9C2細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液于75 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d進(jìn)行換液，吸去舊培養(yǎng)基，加入1 mL 2.5 g/L胰酶消化。顯微鏡下觀察到細(xì)胞脫壁后，立即加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化。將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入15 mL離心管內(nèi)，以1 000 r/min速度離心后去除上清液，加入6 mL新鮮DMEM完全培養(yǎng)液，吸管反復(fù)吹打成細(xì)胞懸液。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)后，以1×105個/孔的密度接種在6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長融合50%～60%時，進(jìn)行分組。空白對照組給予低血清（體積分?jǐn)?shù)為2%）培養(yǎng)基；H2O2刺激造模組給予低血清（體積分?jǐn)?shù)為2%）培養(yǎng)基+H2O2（至終濃度為100 μmol/L）。造模后的細(xì)胞隨機(jī)分成模型對照組、黃芪總苷低劑量組（10 mg/L）、黃芪總苷中劑量組（20 mg/L）、黃芪總苷高劑量組（40 mg/L），以對應(yīng)質(zhì)量濃度處理細(xì)胞48 h，空白對照組和模型對照組不加黃芪總苷處理。

1.5四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測細(xì)胞增殖能力取對數(shù)生長期的H9C2細(xì)胞，接種于96孔板，細(xì)胞密度約1.0×104個/孔，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。加入H2O2（400 μmol/L），到達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)定目標(biāo)時間后，每孔內(nèi)加入MTT（5 mg/mL）10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄去每孔的液體，每孔加入150 μL二甲基亞砜，震蕩5～10 min，使甲臜顆粒充分溶解。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測490 nm及570 nm的吸光度[D（λ）]，分析細(xì)胞存活率的變化。細(xì)胞存活率（p）=[給藥組D（λ）值-空白組D（λ）值]/[陰性對照組D（λ）值-空白組D（λ）值]×100%。

1.6細(xì)胞氧化應(yīng)激水平

1.6.1 羥胺法檢測SOD活性 收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2遍，用預(yù)冷的PBS在4℃進(jìn)行勻漿、離心，取上清液作為待測樣品，嚴(yán)格按照SOD檢測試劑盒說明書配制工作液。待測樣本加入工作液后37℃孵育30 min，用SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度D（λ），按照說明書計(jì)算SOD活性。SOD活力[J/（U·mL-1）]=[對照D（λ）值-測定D（λ）值]/50% × 反應(yīng)體系的稀釋倍數(shù)×樣品測試前的稀釋倍數(shù)。

1.6.2 硫代巴比妥酸（TBA）法檢測MDA含量 具體步驟按照MDA檢測試劑盒說明書進(jìn)行，應(yīng)用酶標(biāo)儀在530～540 nm之間測定吸光度D（λ），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品溶液中的MDA含量后，通過單位質(zhì)量的蛋白含量[b/（μmol·mg-1）]來表示最初樣品中的MDA含量。

1.6.3 化學(xué)熒光法檢測ROS水平 將H9C2細(xì)胞接種于6孔板，按照ROS檢測試劑盒說明書配制終濃度為10 μmol/L的2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），待測細(xì)胞處置好后去上清，加入稀釋好的DCFH-DA使細(xì)胞能被充分蓋住為宜，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，洗掉粘附在細(xì)胞表面的DCFH-DA，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，結(jié)果以熒光度值表示。

1.7Western blot法檢測PI3K/AKT通路p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT的表達(dá)冰面上采用RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，每5 min振蕩1次，裂解20 min，4℃15 000 r/min離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）2.5 h，轉(zhuǎn)膜，5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育一抗p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT 4℃過夜；TBST洗10 min封閉，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min重復(fù)3次，曝光顯影；采用Bio-Rad Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8統(tǒng)計(jì)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組心肌細(xì)胞存活率比較圖1結(jié)果顯示：模型對照組細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組（P＜0.05）；黃芪總苷低、中、高劑量組的細(xì)胞存活率均顯著高于模型對照組（P＜0.05），具有劑量依賴性。

2.2黃芪總苷對氧化指標(biāo)的影響圖2～4結(jié)果顯示：模型對照組SOD活性顯著低于空白對照組（P＜0.05）；黃芪總苷高、中、低劑量組SOD活性顯著高于模型對照組（P＜0.05），具有劑量依賴性。模型對照組MDA含量顯著高于空白對照組（P＜0.05）；黃芪總苷高、中、低劑量組MDA含量顯著低于模型對照組（P＜0.05），具有劑量依賴性。模型對照組的ROS含量顯著高于空白組（P＜0.05）；黃芪總苷高、中、低劑量組MDA含量顯著低于模型對照組（P＜0.05），具有劑量依賴性。

圖1 各組心肌細(xì)胞存活率比較（n=6）Figure 1 Comparison of the cellular viability rate of myocardial cells of various groups（n=6）

圖2 各組心肌細(xì)胞SOD活性比較（n=6）Figure 2 Comparison of the activity of SOD in myocardial cells of various groups（n=6）

圖3 各組心肌細(xì)胞MDA含量比較（n=6）Figure 3 Comparison of the content of MDA in myocardial cells of various groups（n=6）

圖4 各組心肌細(xì)胞ROS水平比較（n=6）Figure 4 Comparison of the level of ROS in myocardial cells of various groups（n=6）

2.3黃芪總苷對PI3K/AKT通路的影響圖5結(jié)果顯示：模型對照組的p-PI3K/P13K比值和p-AKT/AKT比值均顯著低于空白對照組（P＜0.05）；黃芪總苷高、中、低劑量組p-PI3K/P13K比值和p-AKT/AKT比值高于模型對照組，具有劑量依賴性。

3 討論

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要原因之一，其對衰老的影響在近年來不斷被認(rèn)可。Harman D提出了衰老的自由基理論，他認(rèn)為衰老是由2種機(jī)制導(dǎo)致的，一是細(xì)胞內(nèi)過氧化物的作用，致使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)而衰老，二是線粒體呼吸作用[6]。SOD和MDA在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著重要作用。SOD是普遍存在于生物體內(nèi)的金屬酶，能催化機(jī)體自由基的歧化反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，是衡量氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物。有大量研究表明，隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)MDA的含量逐漸升高，SOD的含量逐漸降低[7，8]。而氧化應(yīng)激引起的ROS會引起繼發(fā)性氧化應(yīng)激反應(yīng)，和不飽脂肪酸產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，使之生成過氧化脂質(zhì)，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，引起細(xì)胞的毒性反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA和蛋白等物質(zhì)的氧化，對細(xì)胞造成損傷，減少細(xì)胞的增殖率。另外，氧化應(yīng)激可通過調(diào)控凋亡基因相關(guān)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-11]。本研究以衰老心肌細(xì)胞為研究對象，探討黃芪總苷對H2O2引起的衰老心肌細(xì)胞的影響，結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，衰老心肌細(xì)胞的ROS含量隨著黃芪總苷劑量的升高而呈降低趨勢，黃芪總苷還能增加SOD的活性，減少M(fèi)DA的含量。可見，黃芪總苷可有效降低衰老心肌細(xì)胞中的ROS含量，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 黃芪總苷對衰老心肌細(xì)胞PI3K/AKT通路的影響（n=6）Figure 5 The effect of astragalosides on PI3K/AKT pathway in aging myocardial cells（n=6）

氧化應(yīng)激與磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路密切相關(guān)。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，活化的PI3K通過磷酸化PI（4，5）P2轉(zhuǎn)化成PIP3，并誘導(dǎo)AKT的磷酸化。活化的AKT位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[12]。Kobayashi等[13]以塞利洛爾通過激活PI3K/AKT通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Qi S等[14]亦認(rèn)為，由氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS通過抑制炎癥通路PI3K/AKT，能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，降低細(xì)胞存活率。本研究結(jié)果顯示，黃芪總苷各劑量組p-PI3K/P13K比值和p-AKT/AKT比值顯著高于模型對照組，表明黃芪總苷可能通過激活PI3K/AKT通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抑制心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，黃芪總苷可減緩H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老，其機(jī)制可能與降低氧化應(yīng)激，激活PI3K/AKT通路有關(guān)。