丹參治療糖尿病腎病的網絡藥理學研究

吳芳， 李克明， 隆毅， 王桂芝

（1.東營市第二人民醫院，山東東營，257335；2.山東省中醫藥研究院，山東濟南，250014；3.山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東濟南，250001；4.德州市中醫院，山東德州，253013）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是常見的微血管并發癥，其具有發病率高、致殘率高、危害性大、難以治愈等特點。流行病學研究顯示，我國糖尿病患者已高達9 240萬人[1]，且趨向年輕化，DN也出現相同的趨勢[2]，由DN造成的終末期腎病比例為15%[3]。近年來，丹參制劑在治療DN方面取得了一定的進展[4-6]，本院自制劑丹參降糖方在治療DN中也取得了良好的臨床療效。其中丹參發揮著重要作用。基于此，為進一步探討丹參單味藥所起到的可能作用機制，為后續深入復方藥理研究提供堅實的理論基礎，本研究擬采用網絡藥理學對其進行分析。網絡藥理學（Network Pharmacology）利用復雜網絡與可視化技術，結合中藥治療疾病具有多靶點、多途徑與多靶點協同作用的特點，可為中醫藥機制研究提供新思路與途徑[7]。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1丹參入血活性成分篩選應用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）[8]檢索出丹參成分的數據，通過成分藥物動力學[9]參數進行篩選[10-12]。篩選的條件[13]為藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18；參考前期研究結果與文獻信息適當增補刪減。

1.2丹參調控靶點預測與“活性成分—靶點”網絡構建利用TCMSP作用靶點預測模型演算上述入血活性成分的作用靶點，通過網絡圖像化軟件Cytoscape 3.2.1構建“活性成分—靶點”網絡，分析其網絡特征[14]，其中“節點”（node）表示分子與靶蛋白，“邊”（edge）表示丹參成分與靶點之間的關系。

1.3已知的DN相關疾病靶點檢索檢索TTD[15]（http：//bidd.nus.edu.sg/BIDD-Databases/TTD/TTD.asp） 、 DrugBank[16]（https：//www.drugbank.ca/） 、OMIM[17]（http：//www.omim.org/）、GAD[18]（https：//geneticassociationdb.nih.gov/）、PharmGKB[19]（https：//www.pharmgkb.org/）等與疾病靶點相關的數據庫，以“diabetic nephropathy”為關鍵詞對DN疾病相關靶點進行檢索。

1.4蛋白質—蛋白質相互關系網絡構建和關鍵靶點篩選藥物調控機體的病理生理過程往往存在極為復雜的網絡關系，除直接作用靶點外，更廣泛地存在間接調控的方式；通過蛋白質—蛋白質相互作用關系（protein-protein interaction，PPI）數據的構建與挖掘為研究其復雜關系提供了途徑。利用插件“BisoGenet”對上述入血活性成分和疾病靶點分別進行PPI網絡構建和映射。

通過前期研究與網絡拓撲分析插件“CytoNCA”[20]得到上述網絡關系中的自由度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網絡中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（local average connectivity，LAC）等指標。篩選標準：①DC值大于所有節點DC值中位數2倍的重要節點；②其他幾個指標大于所有節點中位數的節點，即得到關鍵基因。

1.5Pathway富集分析ClueGO是整合了基因本體論信息資源數據庫（GO）與京都基因和基因組百科全書（KEGG）相關數據。本研究采用“ClueGO”[21]對以上獲得的關鍵靶點進行信號通路富集分析以研究丹參治療DN可能的靶點與關鍵通路。其中，不同顏色的節點代表不同類型的信號通路，而其大小與信號通路呈正相關。

2 結果

2.1丹參活性成分篩選與吸收、分布、代謝和排泄（ADME）性質分析本研究通過TCMSP數據庫共檢索到丹參所有成分202個，根據OB和DL等ADME參數篩選到入血活性成分65個，見圖1。

圖1 根據ADME參數篩選出的丹參入血活性成分分布Figure 1 Distribution of the blood active ingredients in Radix Salviae Miltiorrhizae screened with ADME parameters

2.2丹參作用靶點預測及“活性成分—靶點”網絡構建分析利用TCMSP靶點預測模型預測技術對上述活性成分進行作用靶點預測，排除重復靶點，共獲得預測靶點103個，相互對應關系1 349條；其中4個活性成分無對應靶點，予以排除。利用Cytoscape構建上述入血活性成分及預測的作用靶點的關系網絡，如圖2所示。

2.3DN相關靶點檢索分析通過檢索疾病基因相關數據庫，并搜集前期研究和報道共獲得與DN發生、發展密切相關的已知的相關靶點基因113個，其中TTD、DrugBank、OMIM、GAD、Pharm GKB數據庫分別檢索到23、2、43、62、3個。

2.4丹參治療DN的PPI網絡構建與關鍵靶點篩選分析

2.4.1 丹參治療DN的PPI網絡構建分析 通過插件“BisoGenet”對丹參入血活性成分的作用靶點進行PPI網絡構建可知，與其產生直接或間接作用的靶點共5 896個，而這些靶點與靶點之間的相互關系多達131 478個；而與DN疾病相關靶點多達2 842個，靶點與靶點相互關系55 643個。

2.4.2 丹參治療DN的關鍵靶點篩選分析 通過Cytoscape對上述繪制的2個PPI網絡圖抽取交集網絡，采用CytoNCA根據網絡節點的拓撲屬性篩選共發現關鍵節點112個。見篩選策略示意圖3。

圖2 丹參“活性成分—靶點”網絡圖Figure 2 Compound-target network of Radix Salviae Miltiorrhizae

圖3 丹參治療DN關鍵節點的目標篩選策略圖Figure 3 Target screening strategy for key nodes of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

2.4.3 丹參治療DN的機制分析 本研究利用ClueGO對上述關鍵節點進行富集分析，結果顯示，丹參作用于DN的關鍵節點涉及的信號通路，去除過于寬泛的信號通路，獲得26條被顯著富集的信號通路；按照其顯著程度排序依次為雌激素信號通路、神經營養因子信號通路、甲狀腺激素信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信號通路、ErbB信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、催乳素信號通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、B細胞受體信號通路、核因子kappaB（NF-κB）信號通路、T細胞受體信號通路、Ras信號通路、叉頭狀轉錄因子O亞家族蛋白（Fox O）信號通路、趨化因子信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、Toll樣受體信號通路、胰島素（Insulin）信號通路、Wnt信號通路、Hippo信號通路、GnRH信號通路、Adipocytokine信號通路、cAMP信號通路、Notch信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路及轉化生長因子β（TGF-β）信號通路。通路富集分析見圖4、圖5。

3 討論

目前DN是糖尿病的嚴重并發癥之一，是世界范圍內終末期腎病的主要原因，臨床上以蛋白尿和腎臟的形態學及超微結構改變為特征[22]。DN發病機制復雜，涉及高血糖、糖基化終末產物（AGEs）、血流動力學紊亂、代謝異常、炎癥因子和氧化應激。雖然目前對DN的認識不斷增加，但除了控制血糖、血脂水平和高血壓之外，仍缺乏專門針對DN發病機制的治療策略。因此，大多數DN患者的預后較差，尤其是晚期DN患者。如診治延誤，發展到腎病末期，則只能采用透析甚至是腎移植[23，24]。

中醫藥憑借整體觀念和辨證論治理論，在治療DN中研究發揮著重要的作用[25]。DN屬于中醫學“消渴”、“水腫”、“尿濁”和“關格”等范疇，《圣濟總錄》云：“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，能為水腫。”本院自制劑丹參降糖方治療DN取得了良好的臨床療效，丹參作為君藥發揮至關重要的作用，但其作用機制尚不明確，故基于網絡藥理學預測丹參單味中藥在DN的作用機制和關鍵通路。

本研究篩選丹參中入血的活性成分65個，模擬預測103個可能的靶點和1 349個相互關系。“活性成分—靶點”網絡分析結果顯示，丹參酮類、丹參螺旋縮酮內酯、新隱丹參酮、丹參二醇、木犀草素、多孔甾醇、紫丹參戊素等有效成分能作用于網絡中的多個靶點，而IL-2、細胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、雌激素受體1（ESR1）等靶點也能與多個成分作用。基于上述結果可知，丹參的入血活性成分不僅存在協同關系，而且其調控的靶點在DN病理進程中起著關鍵作用。

圖4 丹參治療DN信號通路富集分析網絡圖Figure 4 Enrichment analysis of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

圖5 丹參治療DN信號通路富集分析標注圖Figure 5 Enrichment analysis label of the signaling pathway of Radix Salviae Miltiorrhizae for the treatment of DN

網絡拓撲分析是提取關鍵靶點的過程，本研究分別通過預測活性成分作用靶點和疾病藥物靶點的網絡關系加以映射，以探尋靶點間的直接作用和間接作用關系，結合靶點參數進行核心篩選，最大限度地接近藥物治療疾病的真實靶點。

針對關鍵靶點進行通路富集分析，研究結果顯示，丹參調控DN主要通過影響細胞增殖、細胞因子、炎癥反應、內分泌代謝等多種因素和多通路，且上述通路與目前治療機制類似，主要表現在：①雌激素信號通路：雌二醇通過激活酪氨酸激酶2，抑制TGF-β的合成，從而抑制膠原蛋白ⅣRNA的轉錄，降低膠原蛋白的表達，最終降低了DN纖維化的程度[26]；②神經營養因子信號通路：神經營養因子參與因糖尿病造成的神經系統病變的修復工作，改善DN相關癥狀[27]；③甲狀腺激素受體信號通路：DN患者常伴隨甲狀腺功能的減退，甚至出現低三碘甲狀腺原氨酸（T3）綜合征，血清游離三碘甲腺原氨酸（FT3）指標高低與DN預后好壞呈正相關，FT3可能是DN患者預后的關鍵預測指標[28]；④ErbB信號通路與PI3K-Akt信號通路：ErbB是PI3K-Akt重要的上游通路，而PI3K-Akt是保腎藥物作用與抑制細胞凋亡的關鍵通路[29]；⑤MAPK信號通路：p38MAPK被多種上游病理因素激活后可誘導下游炎癥細胞活化，導致DN腎組織損傷[30]；⑥HIF-1信號通路：DN早期存在缺氧環境，使腎組織缺氧誘導因子lα（HIF-1α）表達增加而調控內皮素1（ET-1）的表達來參與DN病理進程[31]；⑦NF-κB、Adipocytokine、IL-17、趨化因子和Toll樣受體信號通路：多種炎性因子介導的炎性反應可造成血管內皮功能減退和腎小球內皮細胞與神經細胞等損害，這可能是導致DN的重要因素之一[32]；⑧Ras信號通路：腎素—血管緊張素系統（RAS）在腎臟的異常極有可能是DN腎血流動力學病變的重要因素[33]；⑨叉頭狀轉錄因子O（FoxO）信號通路：Fox O1作為胰島素與生長因子信號通路重要因子在調控糖脂代謝、細胞周期以及氧化應激方面發揮重要作用[34]；⑩Insulin信號通路：糖尿病患者的胰島素敏感性受損與腎臟細胞葡萄糖代謝的改變有關，即使在血壓、血糖正常的情況下，胰島素抵抗機制依然可以推進DN蛋白尿病程發展[35]；○11Wnt和TGF-β信號通路：TGF-β 1和Wnt/β-catenin可能存在某種相互關聯的協同作用持續推進DN腎間質纖維化的進程[36]；○12環磷酸腺苷（cAMP）信號通路：通過調節腸道三磷酸腺苷（ATP）和cAMP水平來調控胰高血糖素樣肽1（GLP-1）的釋放，從而發揮優良的降糖作用[37]；○13 Notch信號通路：被激活后可加重腎小球基底膜變厚、系膜擴張和DN纖維化[38]；○14TNF信號通路：TNF-α能促進炎性細胞聚集與粘附，擴張微血管并增加其通透性，通過誘導炎性反應最終損害腎小球組織，刺激IL-6參與微血管病變[39]。

綜上所述，丹參調控DN的作用機制主要涉及細胞增殖、分化及凋亡，調節糖脂代謝、炎癥反應及氧化應激等保護腎小球濾過屏障，減輕腎損傷；通路之間彼此存在著復雜而又微妙的關聯，協同與拮抗作用共存，這很可能是中醫藥治療本病的特點——標本兼治、雙向調節，也闡明了中醫藥的多通路多靶點綜合干預的可行性與治療特色。基于網絡藥理學和生物信息學分析能有效地揭示丹參治療DN可能的作用機制，為后續進一步臨床和實驗研究設計等提供了重要的理論依據，也為DN的治療指明了新的方向。

本研究仍存在一些不足，主要表現在：①未減少藥物成分的相互干擾，僅分析了本方中君藥丹參的作用；②未針對糖尿病腎病不同階段的病理狀態進行亞組分析；③尚未對預測獲得的關鍵靶點和通路進行實驗驗證。后續本課題將結合上述結果和前期研究數據進行更深一步的分子機制研究及臨床驗證。