骨關節炎患者血清中軟骨代謝標記物與骨關節炎的關系研究

徐傳慧，潘 昕，李超峰，張大光*

(1.吉林大學第一醫院，吉林 長春130021；2.吉林大學第二醫院)

骨關節炎(OA)是一種以關節軟骨變性及破壞為主要特征的常見病和多發病，超過50%的65歲以上老年人受OA病痛折磨[1]。最近的研究顯示在OA的病理過程中ATAMTS-5、Syndecan-4，MMP-13，Aggrecan及collagen II和軟骨代謝密切相關。因此，我們利用ELISA技術檢測正常人和骨關節炎患者血清中的上述軟骨代謝標記物的含量和骨關節炎的關系，找出早期診斷骨關節炎的診斷依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料

本研究共納入100名實驗對象，按照K-L分級每組20人，平均年齡(45±15歲)。納入標準為年齡在30-60歲；心功能、肝功能、腎功能正常；排除類風濕性關節炎、感染性關節炎、其他部位骨關節炎，其他疾病的關節炎患者。所有OA患者診斷符合ACR關于OA的診斷標準，所有參加實驗者均經患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2OA患者程度評估

1.2.1所有患者拍攝標準雙膝關節站立位X線片，按照Kellgren和Lawrence的放射學診斷標準進行分組，在癥例報道書中記錄。分級標準見表1。

表1 Kellgren和Lawrence的放射學診斷分級標準

1.2.2次要評價項目 (1)患者的VAS；(2)患者的年齡；(3)患者的體重指數(BMI)。

1.3資料收集

1.3.1一般血液檢查 空腹靜脈血10 ml，測定以下項目，在癥例報告中記錄。(1)測定時期：樣本采集后立即;(2)測定項目：血常規、ESR、CRP;(3)測定方法：檢驗科常規測定方法

1.3.2特殊血液檢查 空腹靜脈血10 ml，所有標本用EDTA抗凝試管，采取后置于4°冰箱不超過7天。為了測定準確，排除技術原因的誤差，我們指定專人進行測試，每例標本測定3次。(1)測定時期：樣本采集后7天之內及術后半年;(2)測定項目:Syndecan-4，MMP-13,ADAMTS-5,Aggrecan,CollagenⅡ、C4S、C6S;(3)主要試劑和儀器：Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S，ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司，Aggrecan、CollagenⅡELISA試劑盒購自武漢友聯特生物技術有限公司。美國Bio-Tek公司ELX800型全自動酶標儀。

1.4ELISA法檢測

采用ELISA法檢測Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表達水平，按照說明書操作，在酶標儀450 nm處測得吸光度(A)值。根據各自標準品的濃度及A值繪制標準曲線并得出相應的計算公式，最后代入各個樣品的A值計算各個樣品的表達水平。

1.5統計學分析

所有的結果都采用SPSS19.0對數據進行統計學分析處理，患者血清中Syndecan-4、MMP-13、 ADAMTS-5、C4S、C6S、Aggrecan,CollagenⅡ的表達水平均以mean±SD表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩因素間相關性分析采用Spearman相關分析，相關性分為弱(r=0.20-0.39)，中度(r：0.40-0.59)，強(r=0.60-0.79)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1血清生物標記物在不同組間中的含量測定100名患者按照X線Kellgren和Lawrence的放射學診斷標準進行分組，其中從正常開始為0級組20人，分別分為Ⅰ級組20人、Ⅱ級組20人、Ⅲ級組20人、Ⅳ級組20人。

2.2骨關節炎患者血清中軟骨代謝標記物與骨關節炎的關系見表2，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ與關節炎程度呈正相關，其中Syndecan-4的相關性最高(r值0.714,P值<0.001),其次為MMP-13(r值0.683，P值<0.001)；CollagenⅡ(r值0.632,P值<0.001)。ADAMTS-5(r值0.511,P值<0.003)的相關性均為中度。C4S(r值-0.546,P值<0.001)、C6S(r值-0.556,P值<0.001)、Aggrecan(r值-0.502,P值<0.003)為負相關。

表2 軟骨代謝標記物與骨關節炎程度的關系

3 討論

OA是目前中老年人關節疼痛及致殘的主要病因，目前的診斷方法無法滿足早期診斷。隨著分子生物學的發展，眾多研究者在OA患者血液中檢測到軟骨組織代謝的一些生物分子，發現這些生物分子與OA的發病密切相關，在X線等影像學出現軟骨明顯退變征象之前，血液中的這些生物分子的濃度即可出現明顯改變，因此被用于OA的診斷、預后及療效監測，所以被稱之為OA生物標記物[2]。

最新的研究表明[3,4]，在OA的病理過程中ADAMTS-5，MMP-13在軟骨破壞過程中起到核心作用，他們的分泌增加破壞細胞外基質中的Aggrecan及collagen II，最終導致軟骨變性及破壞。在這個過程中最新的研究證明Syndecan-4在調控ADAMTS-5的活性過程中起到關鍵作用,并且和MMP-13的調控有關。

在OA的發病機制中MMP-13起到非常關鍵的作用，這在MMP-13基因缺陷鼠模型得到證實。在正常的關節軟骨中II型膠原蛋白(collagen II)被細胞外基質中的蛋白聚糖(proteoglycan)封閉不能與軟骨細胞表面的酪氨酸激酶受體(DDR-2)相互作用，但在OA的關節軟骨中，細胞外基質中的蛋白聚糖減少，使II型膠原蛋白裸露，使DDR-2的表達增強，在DDR-2與II型膠原蛋白相互作用下進一步加強MMP-13的活性。在這個過程中使蛋白聚糖(proteoglycan)減少的關鍵因素是ADAMTS-5,它的表達與活性受多配體蛋白聚糖-4(syndecan-4)的調控，這在Syndecan-4缺陷鼠模型中關節軟骨的ADAMTS-5的活性降低，不易發生OA得到證明。這個過程是在激活素受體樣激酶ALK-1參與下啟動TGF-β信號傳導路完成的[5]。

MMP-13(matrix metalloproteinase 13)，又叫膠原酶3，絕大多數的研究證明MMP-13在OA關節軟骨破壞過程中起到核心作用。Little等2009年利用MMP-13缺乏鼠模型證明MMP-13缺乏鼠關節軟骨破壞減少[6]。這個實驗利用MMP-13缺陷鼠做成DMM(destabilization medial meniscal)OA動物模型，觀察4周和8周時的病理結果。結果在4周時wild type and MMP-13-/- mice的關節軟骨破壞沒有明顯區別，但在8周時MMP-13-/- mice關節軟骨的破壞明顯輕于wild type mice；Aggrecan在4周就有明顯的減少，在8周的時候更進一步減少，證明了MMP-13減少在Aggrecan缺乏狀態下能夠抑制關節軟骨的破壞。Glasson等2005年在Nature上發表文章發現在OA病理過程中關節軟骨中的Aggrecan受到破壞主要是由ADAMTS-5造成的[5]。他們利用ADAMTS-5缺乏鼠制作OA動物模型，發現Aggrecan受到破壞之后使collagen type II裸露，使MMP-13與collagen type II互相作用發揮作用。這個過程syndecan-4結合MMP-3發揮調控ADAMTS-5的作用。

配體蛋白聚糖-4(Syndecan-4)是跨細胞膜表面的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)，它通過硫酸肝素側鏈結合細胞外基質中的各種生長因子和細胞因子發揮作用。在軟骨細胞中它有4種表達類型，目前研究比較清楚的是Syndecan-4。隨著對Syndecan-4認識的逐漸深入，發現它主要在軟骨細胞進化和分化的過程中起到重要的調控作用，在病理過程中也具有非常重要的功能[6，7]。在軟骨組織中，它特異性的作用在肥大軟骨細胞，在OA軟骨中表達增強，尤其是Syndecan-4在調控ADAMTS-5活性過程中起到核心作用[4]。在鼠DMM OA模型研究顯示，減少Syndecan-4的表達可以顯著的減少OA發生，也同時被Syndecan-4基因缺陷鼠的實驗模型所證明。在這個發現過程中，發現Syndecan-4調控ADAMTS-5的活性依賴MMP-3。2008年Kon等的研究發現Syndecan-4保護OPN (osteopontin)調控的急性肝臟損傷[8]，2009年Matsui利用OPN基因缺陷鼠OA模型研究中發現Syndecan-4和MMP-13活性有關[9]。這個研究發現在退行性OA和創傷性OA的關節軟骨中均缺乏OPN，OPN在OA病理過程中是保護性因素，在OA的病理過程中Syndecan-4抑制OPN的表達，調控MMP-13活性增強，MMP-13主要分解關節軟骨中的type II collagen。因此得出結論，OPN在OA病理過程中起到非常關鍵的作用，并且和MMP-13一起相互作用使蛋白聚糖減少。2011年Shi等報道在平滑肌細胞中Syndecan通過FAK-ERK系統調控MMP-13的表達[10]。

在本次研究的血清中軟骨代謝標記物結果中，Syndecan-4、MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、C4S、C6S、Aggrecan與骨關節炎患者骨關節炎病變程度存在著不同程度的相關性。其中Syndecan-4、MMP-13、CollagenⅡ，可作為骨關節炎早期診斷的輔助檢查項目，CollagenⅡ、C4S、C6S可反映出骨關節炎的嚴重程度。