腦啡肽酶作為診斷心力衰竭生物學標記的研究

劉 寧，史永鋒，關一諾，趙 青，吳 迪，武軍鐸，高大松，劉 斌*

(1.吉林大學第二醫院 心血管內科,吉林 長春130041；2.長春恒晨生物科技有限公司)

心力衰竭(heart failure ，HF)是一種心臟疾病的終末期臨床綜合征，可由多種心臟疾病引發。在我國，心力衰竭發病率為0.9%，患病率隨著年齡增加顯著上升[1]。心力衰竭患者的表現及病癥大多類似，但是病因往往各不相同，且大多數患者很難查到確切的病因。因此給疾病的治療帶來了很大的困難，找到一種特殊的靶向物質，針對靶向物質檢測心力衰竭是迫切需要的。

腦啡肽酶(Neprilysin,NEP)也稱中性內肽酶，是一種膜結合的金屬內肽酶[2]。上世紀90年代，研究人員合成NEP抑制劑并與血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)聯合使用治療心力衰竭取得了一定進展[3]。近些年來，腦啡肽酶作為心力衰竭診斷的新靶點受到了極大的關注[4]。目前，已有相關報道證實NEP可以作為HF患者的病理生物標志物。本研究旨在研究腦啡肽穩定性是否適合作為心力衰竭生物學標志，以及研究其在血清中含量與活性的關系。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

采用腦啡肽酶檢測試劑盒(酶聯免疫吸附法)(長春恒曉生物科技有限責任公司)測定血液樣本中的腦啡肽酶含量；采用腦啡肽酶活性檢測試劑盒測定血液樣本中腦啡肽酶活性。測試所用儀器為賽默飛世爾酶標儀Varioskan LUX， 美國。

1.2 研究方法

1.2.1標本采集

抽取心力衰竭患者空腹血液2 ml，于非抗凝管中。采集后的血液4℃保存，并在4 h內3 000 rpm離心10分鐘，緩慢吸出上層血清，轉入EP管中。

1.2.2檢測方法

(1)血清中NEP穩定性研究：將30個心力衰竭患者的血清放入一個50 ml離心管中，渦旋混勻后分裝，每管200 μl。將獲得的多管混合血清分組，分別放入-80℃、-20℃和4℃中保存。以-80℃中的樣本作為對照組，測定4℃保存8 h、12 h、16 h和24 h的樣本中NEP含量。同樣，以-80℃中的樣本作為對照組，測定-20℃保存7 d、14 d、21 d和28 d的樣本中NEP含量。

(2)血清中NEP含量及酶活性相關性研究：分別用NEP含量檢測試劑盒和NEP酶活性檢測試劑盒測試40例患者血清中的NEP。通過相關性分析比對，血清中NEP含量及活性關系。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行數據分析處理。計量資料以均數±標準差(x—±s)表示，各組數據間采用t檢驗；P<0.05時差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清中NEP的穩定性研究

研究結果表明(表1)，分離后的血清在4℃中保存24 h之內，其性質穩定，未見顯著下降(P>0.05)。-20℃保存的血清其保存穩定時間較長，通過實驗結果可見(表2)，-20℃保存的血清28 d后其含量下降并不顯著(P>0.05)。

表1 4℃保存血清中NEP穩定性(pg/ml)

表2 -20℃保存血清中NEP穩定性(pg/ml)

2.2 血清中NEP含量及酶活性關系的研究

采用NEP濃度測量和酶活性測量試劑盒對同一批患者血清進行檢測，檢測結果進行相關性分析(圖1)，可已看出血清中NEP含量與酶活性成正相關，相關系數R2為0.7017，二者相關性較強。

圖1 血清中NEP濃度與酶活性相關性

3 討論

NEP作為膜結合蛋白，與 其他類似蛋白有著相同的性質，即可以從細胞膜表面釋放，產生保持催化活性的非膜相關形式[5]。早在30年前，科研人員就發現血清中的NEP活性與急性呼吸窘迫綜合征和心源性肺水腫相關[6]。而最近才有研究提供證據，顯示NEP在心力衰竭患者中可作為病理學生物標志替代物[7]。

有研究人員評估了1069個慢性心衰患者，患者中主要是射血分數降低的心力衰竭(HFrEF)患者[5]，通過多因素復雜分析NT-proBNP與可溶性NEP與患者的住院及死亡風險有顯著的相關性。直接比較NT-proBNP與可溶性NEP可以發現NEP在神經激素調節中的核心作用。此外，研究顯示可溶性NEP受合并癥影響較強，尤其是腎功能障礙和肥胖癥的影響[8]。而在射血分數保留的心力衰竭(HFpEF)患者中，可溶性NEP的表達量與預后并無顯著相關性。一些研究人員還發現，BNP水平高的患者血液中可溶性NEP水平也較高，但是研究人員沒有研究他們與預后的關系[9]。

以往的這些研究都預示著可溶性NEP可以作為一種診斷心力衰竭的新的生物學標記物。然而，目前各種檢驗NEP水平的實驗都需要進一步的完善和驗證。綜合先前的研究，研究報告中可溶性NEP均保存在-80℃中，但是沒有實驗人員對可溶性NEP在血清中的穩定性進行研究。要作為可診斷的生物學標記物，需要有一定的穩定性，本研究發現從人血清中的NEP在4℃環境中可以保存24 h，在-20℃中可以保存28 d，其穩定性與-80℃中保存的樣本其含量無顯著差異(P>0.05)。這說明人血清中的可溶性NEP具有較好的穩定性，基本可以滿足臨床檢測對樣本儲存和復檢的需求。

另外，還有一點值得注意的是NEP是成熟中性粒細胞的表面標記[10]，因此適當離心和樣本分離是防止不必要的膜結合NEP污染的關鍵。在適當離心之后，血清樣本原則上是非細胞的，而血漿可能含有殘留的細胞物質，會對結果分析造成混淆，因此本實驗選擇血清作為實驗樣本。

通過對之前研究總結發現，大多數研究人員選擇研究NEP在血液中的濃度來研究其對心力衰竭患者的診斷作用。而NEP作為一種酶，其在心力衰竭發生發展過程中的作用主要體現在他的酶活性強弱方面。因此了解血液樣本中NEP含量與NEP酶活性之間的關系，對其研究有一定指導性的意見。本研究通過對40例心衰患者血液樣本同時檢測NEP含量及活性，結果顯示，在人血液樣本中NEP含量及活性成正相關(r2=0.7017)，相關性較強。因此可以通過研究血液中NEP的含量來了間接顯示其酶活性強弱。

綜上所述，NEP在人血樣本中較穩定，可以滿足臨床檢測對樣本儲存及保留復檢的要求。結合之前的研究結果，NEP有望成為心力衰竭診斷的生物學標記。只是檢測方法還需要研究人員不斷完善。