RBM5、EGFR和KRAS在非小細胞肺癌中的表達及其意義

趙 敏，田 暢，邸 鑫，金 鑫，叢 珊，劉伽瑩，李然偉，王 珂*

(吉林大學第二醫院 1.呼吸與危重癥醫學科，2.泌尿外科，吉林 長春130041)

肺癌是世界上發病率和死亡率最高的最惡性腫瘤，預計2018年新增肺癌病例210萬例，死亡180萬例，占癌癥死亡人數的五分之一(18.4%)[1]。肺癌通常分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)[2]。我國每年新發肺癌病例約73.3萬例，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占80%-85%[3]。肺癌患者五年總生存率為17%，而臨床IV期的肺癌患者的五年生存率低于2%[4]。因此積極探索肺癌的發病機制，發現新的肺癌相關生物標志物對改善肺癌患者的治療和預后至關重要。

RNA結合基序蛋白-5(RNA binding motif 5， RBM5)是RBM(RNA Binding Motif)家族成員之一，也是RBM家族中最受關注的成員。RBM5 (也被稱為 g15、LUCA-15及H37)位于假定的人類腫瘤抑制基因區域3p21.3。這個區域共有19個基因，這19個基因都在不同程度上表現出了相應的腫瘤抑制作用，RBM5位于這19個基因的末端[5-7]。RBM5主要分布于細胞核，具有識別、結合RNA，參與機體內RNA轉錄、翻譯、基因表達、細胞增殖以及調控細胞周期及凋亡等功能，目前研究證實，RBM5是潛在的腫瘤抑制因子[8]。

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)信號轉導系統在非小細胞肺癌(NSCLC)的發病中起了非常重要的作用，尤其在腺癌的發病過程中。研究表明，80%的NSCLCs患者，EGFR的表達增高[9]；20%的肺癌患者組織中(多見于支氣管肺泡癌及腺癌)HER2的表達增高[10]；同時也發現，在許多不同病理類型的肺癌中，鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)的表達明顯增高。除此之外，研究發現[11]：腺癌病人的KRAS、EGFR及HER2的基因突變多與吸煙史有關。例如：EGFR的基因突變多見于無吸煙史的腺癌病人(尤其是亞洲女性)；而KRAS的基因突變多見于有吸煙史的腺癌及鱗癌病人(非亞裔男性)；KRAS的基因突變也見于無吸煙史的腺癌病人，但其突變類型不同于有吸煙史的腺癌及鱗癌病人。

本課題組[12]前期研究已經證實：在人非小細胞肺癌組織中腫瘤抑制基因RBM5表達降低，癌基因EGFR,KRAS表達增高，提示RBM5基因表達缺失與EGFR,KRAS基因過表達共同參與了非小細胞肺癌的發生。在人非小細胞肺癌中RBM5蛋白表達水平與EGFR、KRAS蛋白表達呈負相關，RBM5可能作為EGFR途徑的上游基因，可在體內微環境中，通過增加RBM5表達下調EGFR、KRAS水平的途徑，抑制肺癌組織、細胞增殖。

對驅動基因及突變基因的檢測是針對NSCLC患者國內、外診治的共識，但該技術因所需組織標本取材困難，操作流程繁瑣，周期長，對設備要求高，故難以推廣，且目前大多數研究項目及臨床應用主要是針對已經診斷的肺癌或肺癌晚期病人，從而指導NSCLC患者靶向用藥方案，故組織中目的基因的檢測尚不能也不適合做到NSCLC早期診斷及療效評估。而本實驗將組織中基因水平的檢測，轉化為血清中目的蛋白的檢測，相比較于組織的取材困難，患者血清的獲得較為簡單，而基因水平的檢測也較蛋白水平的檢測較為繁瑣，故如果血清中驅動基因和突變基因表達水平與組織中具有較高的相似性，我們便可以用血清中目的基因表達水平的檢測來代替組織中目的基因的檢測，從而做到NSCLC早期診斷及療效評估。

本研究通過測定組織及血清中上述基因表達水平，比較組織與血清表達水平差異，分析三者與臨床病理類型，淋巴結轉移，吸煙史，年齡，性別等的關系；從而為非小細胞肺癌的精準診治提供更方便快捷的實驗室檢測方法。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2017年8月至2018年8月在吉林大學第二醫院收治的44例非小細胞肺癌(NSCLC)患者作為實驗組，所有患者均經術后病理或支氣管鏡活檢病理證實為非小細胞肺癌(其中有2例經支氣管鏡活檢病理證實，故只有血清，無癌組織與癌旁組織)。其中鱗狀細胞癌22例，腺癌22例；按照國際肺癌研究學會(IASLC)2017年頒布的第8版肺癌TNM分期[13]進行劃分：Ⅰ期10例，Ⅱ期21例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例。其中男性32例，女性12例，年齡為46-78歲，平均年齡為61.00±7.27歲；選取同期健康體檢人22例作為對照組，其中男性10人，女性12人，年齡為47-83歲，平均年齡61.00±11.05歲；經相關檢查未發現肺癌或其他腫瘤性疾病。

1.2入組標準及排除標準非小細胞肺癌入組患者結合臨床癥狀、體征，均經病理學確診為非小細胞肺癌，均具有完整的病歷資料。排除存在嚴重心臟及肝腎疾病、自身免疫性疾病、嚴重并發癥等情況患者。

1.3主要試劑和儀器Light Cycler 480Ⅱ高通量實時熒光定量PCR儀(羅氏,美國)，TransZol Up PLUS RNA Kit(北京全是金生物技術有限公司，中國)， TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal) (北京全是金生物技術有限公司，中國),DNA引物合成(生工生物有限責任公司，中國)，TransStart Top Green qPCR SuperMix(北京全是金生物技術有限公司，中國)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)，兔抗RBM5多克隆抗體(生工生物工程(上海)股份有限公司，中國)Human EGFR ELISA KIT(R&D，美國),Human KRAS ELISA KIT(R&D，美國)，Human RBM5 ELISA KIT(江萊生物，中國)，Thermo Scientific Varioskan Flash全波長掃描式多功能讀數儀(賽默飛世爾科技，美國)

1.4RT-QPCR法檢測組織中RBM5、EGFR、KRASmRNA表達水平用Trizol法提取上述肺癌及癌旁組織標本中總RNA，反轉錄試劑盒將RNA反轉錄合成cDNA,RT-PCR法檢測RBM5、EGFR、KRAS的相對表達水平，引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。根據Ct值采用法計算癌及癌旁組織目的基因的相對表達水平，△Ct值=目的基因Ct值-內參基因Ct值。

1.5Westernblot法測定組織中RBM5、EGFR、KRAS蛋白表達水平采用RIPA裂解緩沖液冰上裂解組織，BCA法測定蛋白濃度，每個樣品取30 μg上樣，10%SDS-PAGE,將蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂乳封閉2 h，與上述基因抗體(按說明書稀釋比例稀釋)，4℃孵育過夜。經PBST洗滌3次，加入HRP標記的相應二抗(稀釋比例1∶2000)，室溫搖床孵育40 min，TBST洗滌3次，加入ECL顯色，采用化學發光成像儀檢測目的蛋白的相對表達水平，內參采用β-actin。

1.6ELISA法測定NSCLC和正常人血清中RBM5、EGFR及KRAS蛋白表達水平嚴格按RBM5、EGFR和KRAS檢測試劑盒進行操作，檢測RBM5、EGFR和KRAS的表達水平。加樣，37℃溫育30 min，洗滌5次，加酶標抗體50 μl，溫育、洗滌，加顯色液顯色，檢測其吸光度(A)值，根據標準曲線計算出RBM5、EGFR和KRAS的水平。

1.7統計學分析采用SPSS 24.0 統計軟件進行統計學分析。先對數據進行正態性檢驗，根據實驗數據是否符合正態分布,使用t檢驗或Wilcoxon符號秩檢驗進行統計分析。檢驗水準α=0.05。用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

2 結果

2.1肺組織中RBM5、EGFR和KRASmRNA及蛋白表達水平

肺癌和癌旁組織中上述基因mRNA表達水平(2Δct)均呈非正態分布。

2.1.1癌旁組織RBM5 mRNA的表達水平最小值為1.77×10-3，最大值為3.73，中位數為4.54×10-2，95%區間距為0.051-0.655。肺癌組織RBM5 mRNA的表達水平最小值為5.45×10-3，最大值為0.33，中位數為3.35×10-2，95%區間距為0.034-0.071；肺癌組織中RBM5 mRNA的表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。

2.1.2癌旁組織EGFR mRNA的表達水平最小值為4.14×10-3，最大值為0.30，中位數為3.65×10-2，95%區間距為0.036-0.094。肺癌組織EGFR mRNA的表達水平最小值為17.74×10-3，最大值為1.10，中位數為5.04×10-2，95%區間距為0.028-0.168。肺癌組織中EGFR mRNA的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

癌旁組織KRAS mRNA的表達水平最小值為0.80×10-3，最大值為0.99，中位數為2.59×10-2，95%區間距為0.073-0.288。肺癌組織KRAS mRNA的表達水平最小值為6.92×10-3，最大值為0.97，中位數為5.53×10-2，95%區間距為0.116-0.311；肺癌組織中KRAS mRNA的表達水平高于癌旁組織,但二者之間沒有統計學差異(表2)。非小細胞肺癌組織中RBM5蛋白質表達水平較癌旁組織降低，EGFR蛋白水平升高，KRAS表達水平沒有明顯變化。(圖1)。

P:para-carcinoma tissues;T:tumor

Fig.1ExpressionofRBM5,EGFRandKRASproteininNSCLCtissueandpara-tumortissuebyWesternblot

2.1.3其中伴有淋巴結轉移的非小細胞肺癌EGFR mRNA表達水平顯著高于無淋巴結轉移的非小細胞肺癌EGFR mRNA表達水平(P<0.05)；與癌旁組織對比，男性組、低年齡組、無吸煙史組、鱗癌組及有淋巴結轉移組癌組織中RBM5 mRNA表達水平降低(P<0.05)；高年齡組、無吸煙史組及腺癌組，組織中EGFR mRNA表達水平升高(P<0.05)；臨床Ⅰ期以及無淋巴結轉移組，非小細胞肺癌組織中KRAS mRNA表達水平升高(P<0.05)(表3)。

Tab.2 Levels of RBM5,EGFR and KRAS mRNA in NSCLC

Tab.3 Association of RBM5,EGFR,and KRAS mRNA with clinicopathological characteristics in NSCLC

*：There was significant difference between tumor and para-carcinoma tissues (P<0.05);#:The specific clinical categories in cancer tissues were significantly different (P<0.05).

2.2血清中RBM5、EGFR和KRAS蛋白表達水平

血清中上述基因蛋白表達水平均呈正態分布，正常對照組中的RBM5蛋白表達水平為(7.74±1.98 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表達水平為(4.74±1.62 ng/ml)，肺癌患者血清中RBM5蛋白表達水平顯著低于正常對照組(P<0.01)，其中有淋巴結轉移組RBM5蛋白表達水平(4.18±1.19 ng/ml)明顯低于無淋巴結轉移組RBM5蛋白表達水平(5.30±1.81 ng/ml)(P<0.05)；正常對照組中的EGFR蛋白表達水平為(7.61±1.91 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表達水平為(10.51±2.37 ng/l)，肺癌患者血清中EGFR蛋白表達水平顯著高于正常對照組(P<0.01)。正常對照組中的KRAS蛋白表達水平為(2.97±0.71 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表達水平為(3.82±1.13 ng/ml)，肺癌患者血清中KRAS蛋白表達水平顯著高于正常對照組(P<0.01)(圖2)。

Fig.2 Levels of serum RBM5,EGFR and KRAS protein ；**：P<0.01vs control group

3 討論

目前肺癌是世界范圍內癌癥相關死亡率最高的腫瘤性疾病，每年死亡率18.4%[1]。近年來新型肺癌相關生物標志物的發現及應用對于改善肺癌尤其是非小細胞肺癌的早期診斷、治療及預后起到至關重要的作用。大量研究結果顯示：RBM5是調節癌細胞基因轉錄和mRNA剪接的核蛋白。在神經鞘瘤和75%原發肺癌樣本中發現RBM5的表達明顯低于正常組織[14,15]。而目前關于EGFR和KRAS在癌癥中的研究已經證明：EGFR是由細胞外配體結合域和細胞內酪氨酸激酶域組成的170kD跨膜糖蛋白，它在許多上皮性腫瘤中異常激活，導致細胞增殖、侵襲、轉移和預后差，而更重要的是在40%至85%的初級NSCLC可以檢測到EGFR的表達[16]。RAS家族三個成員在細胞中的突變廣泛發生在多種人類癌癥中，其中KRAS的突變是RAS家族成員中最常見的。RAS家族中大約在30%的人類癌癥中發現了突變；當然，這其中也包括肺癌[17]。在本研究中，利用RT-qPCR法對RBM5、EGFR及KRAS在NSCLC組織與癌旁組織的mRNA表達進行檢測，結果顯示RBM5在癌組織中的表達含量明顯較癌旁組織低,EGFR的表達含量明顯升高，KRAS沒有明顯相關性，并且經過Western blot驗證組織蛋白質也符合這一趨勢，這與梁紅[12]等人的研究結論相似。進一步分析三種基因與臨床及病理相關性發現，在男性組、低年齡組、無吸煙史組、鱗癌組及有淋巴結轉移組癌組織中RBM5 mRNA表達水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。高年齡、無吸煙史及腺癌組，非小細胞肺癌組織中EGFR mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。臨床Ⅰ期以及無淋巴結轉移組，非小細胞肺癌組織中KRAS mRNA表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)。根據Amos CI[18]的報道：只有不到11%的重度吸煙者最終發展成惡性腫瘤，提示吸煙與NSCLC的發病并無特定關系。相關研究人員同樣證明吸煙對3p21.3這一片段抑癌作用并沒有明顯影響[19]，而我們實驗的結果得出非吸煙者中癌與癌旁組織中RBM5和EGFR表達含量差異顯著，我們實驗結論也補充了無吸煙組的RBM5表達水平癌與癌旁組織差異大。而在Snjezana Dogan[20]發現EGFR突變在43%的不吸煙者(NS)和11%的吸煙者中。我們的實驗結果也與其相符，在無吸煙史的癌組織中EGFR表達明顯高于癌旁組織。相關研究表明，EGFR通路在細胞增殖、血管生成和存活中起重要作用。鑒于其對細胞周期進展、凋亡、血管生成、腫瘤細胞運動和轉移的影響，它顯然與腫瘤的生長和進展有關[21]。我們的實驗結果也驗證了這一結論，有淋巴結轉移的非小細胞肺癌EGFR mRNA表達水平顯著高于無淋巴結轉移的非小細胞肺癌EGFR mRNA表達水平(P<0.05)。這可以指導我們更好的應用EGFR的靶向治療藥物治療非小細胞肺癌。

目前已有多項[22]研究論證了檢測血清中EGFR表達含量作為肺癌診斷指標的可行性；而Dr.Ryan[23]課題組得出血清中KRAS2突變體是結直腸腫瘤復發臨床癥狀表現前的潛在標志；目前還沒有任何關于血清RBM5與癌癥的報道。本研究結果顯示血清RBM5、EGFR及KRAS在健康者及非小細胞肺癌中都有表達，并且在非小細胞肺癌患者血清中RBM5表達水平低于健康者(P<0.05)，而EGFR和KRAS表達高于健康者(P<0.05)。此結果與組織中RBM5、EGFR的結果具有高度相似性，但也得出KRAS在非小細胞肺癌患者血清中高表達這一結論，此結論與梁紅[12]等人在測定癌組織中KRAS表達情況時，得出結論一致，以上結果提示血清RBM5、EGFR及KRAS可作為非小細胞肺癌患者新的血清標志物。Oh等人[19]發現腫瘤抑制因子RBM5/H37改變參與轉移相關的基因的表達，表明RBM5表達的缺失可能增加腫瘤的轉移潛能。我們的研究結果得出伴有淋巴結轉移的NSCLC患者血清中RBM5表達含量低于無淋巴結轉移患者中血清中，證實了RBM5表達降低與轉移相關的臨床病理特征之間的顯著關聯，支持上述研究。該結論也與彭杰等人[24]在研究胰腺導管癌中RBM5與淋巴結轉移相關性得出的結論類似。提示血清RBM5可能是預測非小細胞肺癌淋巴結轉移的一項指標，與非小細胞肺癌轉移有相關性。

綜上所述，RBM5和EGFR在非小細胞肺癌患者無論是病理標本還是血清中都存在相同趨勢，與淋巴結轉移均有相關性，而我們檢測到KRAS只在NSCLC患者血清中有明顯升高，在此推測腫瘤抑制基因RBM5在NSCLC發生發展過程中起到負性調控作用，而EGFR和KRAS起到正性調控作用；血清中RBM5和EGFR可能成為判斷腫瘤早期轉移新指標以及腫瘤新治療靶點。

作者簡介：趙敏(1994-)，內蒙古自治區包頭市人，在讀醫學碩士；王珂，教授，主任醫師，博士研究生導師。