miR-155對結腸癌細胞增殖及線粒體凋亡信號通路的影響

李 濤，宛迎春，蘇子源，周長玉*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 消化內科，吉林 長春130033；2.長春中醫藥大學附屬醫院)

結直腸癌是男性中最常見的3種癌癥之一，也是女性最常見的兩種癌癥之一。全球平均每年有100萬人被診斷出患有結直腸癌[1]。死亡率隨疾病分期有顯著差異;有5年以上的存活率90%的I期患者，10%-20%的轉移患者[2]。結直腸癌存在的類型多樣，約40%的病例攜帶KRAS突變，10%為BRAF突變[3]。與野生型KRAS患者相比，突變的KRAS預示著不良的預后和生存，同時耐受抗表皮生長因子受體(EGFR)治療[4-6]。

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發病率中居第三位，在癌癥相關死亡中排名第四，嚴重危害全球范圍內居民健康，給社會和家庭經濟造成沉重負擔[1]。結腸癌的主要危害來源于術后的復發和轉移，特別是晚期結腸癌患者，如何預防和降低轉移成為治療結腸癌的關鍵[2]。

microRNAs (miRNAs)是一類內源性轉錄調節RNA分子，長度約22個核苷酸，參與動植物轉錄后基因表達調控[3,4]。近來的研究顯示，miRNA與腫瘤的發生發展密切相關，通過對目標基因的調節，參與腫瘤細胞生長，增殖和轉移的調節[5,6]。本課題擬通過實驗明確miR-155對結腸癌細胞增殖和線粒體凋亡信號通路的影響，為臨床治療結腸癌提供新的策略和作用靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

結腸癌組織和癌旁組織收集于吉林大學中日聯誼醫院，人結腸癌HCT116，SW480細胞和人結腸上皮細胞NCM460購買于中國科學院細胞庫.細胞培養用胎牛血清FBS和DMEM高糖培養液購買于美國GIBCO公司，1640培養液和細胞消化用胰酶購買于美國Hyclone 公司。miR-155 inhibitor和對照購買自上海吉瑪制藥技術有限公司，Bax和cytochrome C抗體購買自美國CST公司。

1.2 RT-qPCR

利用Trizol試劑方法提取細胞中總RNA，提取總RNA后利用TaqMan進行實時逆轉錄聚合酶反應(RT-PCR)，miR-155所用引物和內源性對照U6購買自上海吉瑪制藥技術有限公司，利用ABI 7300檢測系統對結果進行檢測。

1.3 細胞轉染

利用lipofectamine3000進行細胞轉染，細胞培養至80%進行細胞轉染，將細胞培養液換成Opti-MEM培養液，利用Opti-MEM稀釋lip3000和DNA，同時在DNA溶解液中加入P3000，室溫孵育10 min，滴入已經換成Opti-MEM的平皿中，轉染5 h后，換成正常細胞培養液，24 h后進行相應實驗。

1.4 CCK8檢測結腸癌細胞增殖率

細胞生長至對數生長期后，進行細胞傳代，計數，鋪96孔板，按照每孔2000個細胞進行鋪板，鋪板后過夜等待細胞完全貼壁后進行不同分組作用。按照不同的分組作用細胞，觀察細胞狀態完成相應的作用，待作用時間完成后，每孔加入10 μl CCK8溶液，輕輕混勻，放入浮箱內繼續培養3 h后停止作用，利用酶標儀檢測吸光度值(OD值，450 nm)。

1.5 Western Blotting檢測結腸癌細胞內蛋白表達

蛋白是細胞內發揮生物學功能的大分子物質，檢測蛋白水平的改變可以反應細胞內一些現象的發生，細胞蛋白提取和表達檢測步驟如下，將對數生長期的細胞按照分組進行分皿，待細胞完全貼壁后進行相應的處理，處理完成后進行蛋白的提取，棄除細胞正常培養液，冷卻的PBS洗細胞2次后，完全吸出PBS，加入150 μl RIPA細胞裂解液，均勻鋪開后，放置冰上作用5 min后，利用細胞刮將細胞完全刮除后轉至EP管中，放入4℃冰箱搖勻作用30 min，3 000 rpm/min離心20 min，取上清后對蛋白濃度進行定量(BCA方法)。根據蛋白濃度絕對上樣體積，蛋白中加入loading buffer，95℃煮蛋白使其變性后，進行蛋白質丙烯酰胺凝膠電泳分離不同分子量的蛋白，將膠上的蛋白通過轉模轉移至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉中封閉2 h，根據檢測蛋白的不同加入相應的一抗，低溫孵育過夜，第二天PBST清膜3次后加入相應的二抗，室溫孵育2 h后， PBST清膜3次， ECL發光顯示，對結果進行拍照分析。

1.6 流式細胞儀檢測不同分組結腸癌細胞凋亡率

利用流式細胞術檢測不同分組下結腸癌細胞的凋亡率，利用Annexin V-FITC/PI雙染色檢測凋亡率的改變。具體步驟如下，將對數生長期的細胞按照分組進行分皿，待細胞完全貼壁后進行相應的處理，藥物作用完成后，消化收集細胞，利用冷PBS清洗細胞2次后加入染料Annexin V-FITC和PI溶液，避光作用0.5 h，利用流式細胞術進行熒光強度的檢測。

1.7 統計學方法

對CCK8，流式細胞術和western blotting數據結果進行統計分析。利用SPSS 16.0統計學軟件進行分析，兩組比較采用t檢驗的方法，3組及3組以上采用方差分析的方法，P<0.05定義為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織與癌旁組織中miR-155表達水平

為明確miR-155在結腸癌組織中的表達，我們首先利用了RT-qPCR的方法檢測了30對組織中miR-155表達水平，結果顯示，與癌旁組織相比較，結腸癌組織中miR-155表達水平明顯升高，差異具有統計學意義，見表1。

表1 RT-qPCR檢測結腸癌和癌旁組織miR-155表達水平

*與癌旁組織相比較有統計學差異，P<0.05

2.2 miR-155 抑制劑對結腸癌細胞增殖率的影響

在檢測到miR-155表達水平上調的基礎上，我們進一步探討抑制miR-155對結腸癌細胞增殖率的影響，我們檢測了HCT116和SW480兩種結腸癌細胞。結果發現，轉染miR-155抑制劑可以明顯的降低兩種結腸癌細胞的增殖速度，見圖1和圖2。

圖1 miR-155 抑制劑對HCT116細胞增殖率的影響

圖2 miR-155 抑制劑對SW480細胞增殖率的影響

2.3 miR-155 inhibitor對結腸癌細胞凋亡的影響

我們進一步檢測了miR-155抑制劑其兩種結腸癌細胞凋亡率的影響，我們利用流式細胞術檢測了給予miR-155 inhibitor對凋亡率的影響，結果發現，與對照組相比較，miR-155 inhibitor可以明顯的增加兩種結腸癌凋亡率，差異具有統計學意義，結果見表2。

表2 miR-155 inhibitor對HCT116和SW480細胞凋亡率的影響

*與Control組比較，P<0.05

2.4 miR-155 inhibitor對結腸癌細胞線粒體凋亡相關蛋白表達的影響

研究顯示，線粒體凋亡信號通路在凋亡的發生中發揮了重要的作用，因此我們進一步檢測了線粒體凋亡相關蛋白Bax和Cytochrome C表達水平。Western Blotting結果發現，給予miR-155 inhibitor可以明顯的增加細胞中線粒體凋亡相關蛋白Bax和Cytochrome C表達水平，結果見圖3和圖4。

圖3 miR-155 inhibitor對HCT116和SW480細胞Bax表達水平的影響

圖4 miR-155 inhibitor對HCT116和SW480細胞Cytochrome C表達水平的影響

3 討論

結腸癌是男性和女性中第三常見和第二致命的惡性腫瘤,結腸癌具有很強的環境關聯性和遺傳風險因素[7]。大約5%的結腸癌是由家族性腺瘤性息肉病和林奇綜合征兩種遺傳綜合征。正常結腸的演變成癌前病變和浸潤性癌需要大約10到15年通過遺傳的積累突變體(獲得的)和/或生殖系(遺傳的)。染色體不穩定性、失配修復和CpG高甲基化是結腸癌發生的主要途徑。病理診斷是最重要的結腸癌預后指標[8]。大量的證據表明了miRNAs與腫瘤的密切關系，成為腫瘤診斷和靶向治療的熱點分子[9]。近來的報道顯示出miRNAs家族成員miR-155在多種腫瘤的發生發展中發揮了重要的作用[10]。但是，在結腸癌的發生，細胞增殖以及凋亡中miR-155是否發揮了重要作用還不是很清楚，基于此本課題組開展了本次實驗。

首先檢測了臨床組織樣本中miR-155表達水平，結果發現，與癌旁組織相比較，結腸癌組織中表達水平明顯的升高。為明確miR-155對細胞增殖率和凋亡的影響，我們利用miR-155 inhibitor檢測其對結腸癌細胞增殖率和凋亡率的影響，結果發現，抑制miR-155可以明顯的降低結腸癌細胞的增殖率，增加細胞凋亡的發生，提示miR-155參與了結腸癌細胞增殖和凋亡的調控。

凋亡是細胞內普遍存在的生物學過程，同時是癌癥治療過程中抗癌試劑盒藥物誘導細胞死亡的主要方式[11]。多種信號通路都可以介導細胞凋亡信號通路，其中線粒體凋亡信號通路是最常見的，也是在腫瘤細胞凋亡中發揮主要作用的信號通路[12]。Bcl-2家族蛋白在線粒體凋亡信號通路中發揮重要作用，特別是Bax，其在線粒體外膜形成孔道，促進線粒體內膜和外膜間的cytochrome C釋放到細胞質中，促進了凋亡的發生[13]。

為進一步明確線粒體凋亡信號通路在miR-155抑制劑介導結腸癌細胞凋亡中的作用，我們檢測了線粒體凋亡相關蛋白Bax和cytochrome C，結果發現，兩種表達水平明顯的升高，提示線粒體凋亡信號通路參與了miR-155 抑制劑誘導的結腸癌細胞凋亡。

綜上所述，miR-155在結腸癌組織中呈現高表達，抑制miR-155可以引起結腸癌細胞增殖率的下降和凋亡的升高，線粒體凋亡信號通路參與了凋亡的發生過程。本課題為臨床治療結腸癌提供了新的思路和治療靶點。

作者簡介：周長玉,吉林大學中日聯誼醫院消化科主任醫師.