干細胞源性星形膠質細胞分化中的生長狀態研究

歐 亞，元小冬，張麗麗

(華北理工大學附屬開灤總醫院，河北 唐山063000)

中樞神經系統退行性疾病已經成為我國人口與健康領域中的重大科學與社會問題。目前，神經退行性疾病的發病機制尚不完全清楚，也缺乏有效的治療方法，而干細胞或神經元和神經膠質細胞等目標細胞移植被認為是最有前途的治療方法之一[1,2]。星形膠質細胞是膠質細胞中數量最多、具有重要功能的細胞，可以通過分泌多種神經因子來實現對神經元的營養修復作用。星形膠質細胞分泌的神經營養因子等活性物質在腦內廣泛分布，對神經細胞有一定的營養作用，在保護神經細胞、促進軸突生長、神經損傷修復和維持正常的腦功能中有重要意義。研究發現[3-8]，脂肪間充質干細胞(ADSC)可在體外培養擴增，并通過化學誘導劑分化為星形膠質細胞。但分化過程中細胞數量逐漸減少，嚴重影響進一步實驗的開展。因此，本實驗通過體外培養及誘導技術，檢測誘導過程中細胞生長狀態，并分析導致細胞死亡的原因，為今后實驗打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗取材

本研究所用的脂肪組織為華北理工大學附屬開灤總醫院美容整形中心和唐山金榮整形美容醫院健康成人腹部皮下吸脂整形術后的脂肪組織廢棄物。此項研究經志愿者同意并經華北理工大學倫理委員會批準。

1.2 ADSC的體外提取、培養

脂肪組織取材后，應用Ye等人[3]的方法，將細胞置于恒溫培養箱中進行培養。隨后每3天換液1次，大約在10-14天細胞長滿瓶底，按照1∶2比例進行傳代，之后繼續應用培養液進行培養。

1.3 ADSC向星形膠質細胞誘導分化

收集生長狀態良好的第3-6代ADSC，制成細胞爬片，待細胞生長至70%左右融合時，開始應用以IBMX為主要成分的化學誘導劑(DE-1)進行誘導分化[4]，依據誘導分化反應時間分別分為誘導48 h組、誘導7 d組、誘導14 d組、誘導 21 d組。同時，選取按常規培養無誘導劑的未誘導細胞作為對照組。

1.4 光學顯微鏡及透射電子顯微鏡下觀察誘導后細胞形態

倒置相差顯微鏡下觀察未誘導及誘導48 h、7 d、1 4d和21 d時的細胞形態并攝片。消化、離心收集誘導分化48h的成人ADSC。3%戊二醛、1%餓酸固定，丙醛脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片機切片，2%醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察細胞超微結構、拍照記錄。未誘導的ADSC作為對照。

1.5 免疫熒光細胞化學染色法檢測GFAP表達

取未誘導及誘導后48 h、7 d、14 d、21 d細胞制作爬片，行免疫細胞化學GFAP染色。一抗為鼠抗人GFAP單克隆抗體工作液。操作按試劑盒說明書進行。熒光顯微鏡下觀察并攝片。GFAP染色陽性細胞胞質為棕黃色。計算GFAP染色陽性細胞百分比。

1.6 MTT法檢測分化反應中的細胞存活狀態

培養到第3代的脂肪基質細胞應用胰酶體外消化離心。按1×105/孔的細胞密度將離心后細胞種板(12孔板最為適宜)。在孔板中加入DE-1化學誘導劑,分別誘導48 h、7 d、14 d、21 d，每一時間點作為一個誘導組，未誘導組中不加誘導劑，而是加入完全培養基。加入MTT工作液后，用酶標儀檢測各時間點細胞吸光度值(OD值)，繪制細胞生長狀態曲線(以OD值為縱軸，以時間為橫軸)。

1.7 AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡

采用誘導分化后48 h、7 d、14 d、21d時的星形膠質細胞，胰酶消化離心。PI染液孵化，之后流式細胞儀檢測。采用未加入誘導劑的人脂肪基質細胞作為對照組。每個組重復實驗3次。

1.8 數據統計學分析

所得實驗結果應用Excel 2003 建庫，之后數據采用SPSS13.0軟件包進行統計學整理，所得結果以均數±標準差代表，同一組內不同時間點間的比較均采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 成人ADSC的原代及傳代培養

經過分離、提取的脂肪基質細胞培養至24小時可以看到細胞貼付于培養瓶底。首次換液后可在鏡下觀察到細胞的形態多樣、大小不一，多呈現為類圓形、黑點狀(圖1a)。培養48 h時，多數ADSC胞體變為長梭形，呈類似于成纖維細胞樣形態。7-10 d左右細胞增殖速度加快，鏡下可見大量梭形細胞呈漩渦狀排列，細胞生長到14 d可達到90%融合。傳至第3-6代時，細胞形態基本均勻，呈長梭形，雜質細胞基本去除，此時細胞增生活躍，3-6天即可鋪滿整個瓶底(圖1b)。

2.2 ADSC誘導過程中細胞形態學變化

誘導至5 h時，ADSC形態逐漸開始發生變化，胞體折光性逐漸增強，胞質以胞核為中心向內回縮，ADSC的原始外部胞膜輪廓逐漸模糊。16 h左右細胞胞體折光性顯著增強，呈圓形或多邊形，胞漿回縮更為明顯。低倍鏡下可見細胞伸出多條突起，但高倍鏡下發現細胞這些突起為胞漿不均勻回縮所致，且某些細胞仍能看到ADSC細胞膜的原始外部輪廓(圖2a)。48 h，光鏡下可見典型的星形膠質細胞形態，即胞體圓形，伸出多條細長突起，部分一級突起伸出多條次級突起，胞核圓形，居中，可見到1-2個核仁，但部分細胞的突起末端分化不完全(圖2b)。此后至誘導后14 d，細胞形態基本保持不變(圖2c)。21 d時，胞體折光性減弱，呈三角形或不規則形，部分突起回縮，僅有2-3條較短突起。28 d時，大量細胞脫落、死亡。

圖a為原代培養3 d時細胞，貼壁細胞呈黑點狀；b為成人ADSC傳代至第3代3 d時，成纖維細胞樣形態，并呈旋渦狀生長。

圖1成人ADSC原代及傳代培養后倒置相差顯微鏡下的細胞形態變化特征

圖a箭頭所示為未分化完全細胞；圖b為誘導后48 h細胞；圖c為誘導后14 d細胞。

2.3 誘導后細胞GFAP免疫細胞化學表達

未誘導組無GFAP陽性表達,而在誘導后各個時間組(48 h-21 d)中均可見部分陽性表達細胞，且陽性表達部位主要集中于誘導后細胞的胞體和突起(圖3，表1)。GFAP陽性表達率在誘導后7 d與14 d組之間無明顯差異(P>0.05)，在第7 d組高于48 h組(P<0.05)，14 d組高于21 d組(P<0.05)。

圖a-e分別GFAP在未誘導細胞及分化后48 h、7 d、14 d、21 d的星形膠質細胞中的表達結果，箭頭所示為陽性表達。

因子n未誘導48 h7 d14 d21 dGFAP150±0.0049.87±4.8476.67±4.3274.47±6.6856.47±5.36*

2.4 MTT法檢測分化過程中細胞的生長趨勢

干細胞源性星形膠質細胞在分化過程中OD值結果如圖4所示。可以發現細胞存活率隨誘導分化時間的延長而逐漸呈現下降趨勢，且各組之間(未誘導及誘導后48 h-21 d)具有統計學差異(圖4)。

圖4 MTT法檢測誘導過程中細胞的生長曲線

2.5 流式細胞術檢測分化不同時間點的細胞凋亡

通過流式細胞儀檢測，發現分化前后各組之間的細胞存活率差異具有明顯的統計學意義(P<0.05)。分化后48小時細胞在誘導后各組中數量最多，存活率最高，之后隨分化時間的延長凋亡率逐漸上升，存活率逐漸下降，至21天時存活率達到最低。同時發現，早期細胞凋亡率隨著誘導時間的延長而逐漸呈現上升趨勢，未誘導細胞凋亡率最低，21 d時最高。各組間差異具有統計學意義(P<0.05)。而且細胞晚期凋亡率或壞死率亦隨分化時間延長逐漸上升，未誘導最低，21 d達高峰，各組間差異具有統計學意義(P<0.05)。實驗的機械損傷率在各組間差異無統計學意義(P>0.05)(圖5，表2)。

表2 流式細胞術檢測此誘導反應中細胞存活狀態(x—±s) %

注：n代表實驗重復3次。

圖a-e分別為未誘導細胞及誘導后48 h、7 d、14 d、21 d的細胞凋亡分布情況。左上象限UL： 為機械損傷細胞，右上象限UR：為晚期凋亡或壞死細胞，左下象限LL ：為活細胞，右下象限LR：為早期凋亡細胞。

圖5流式細胞術檢測誘導反應中細胞凋亡分布圖

3 討論

腦血管疾病發生時，AS出現死亡或功能障礙，致使其對損傷神經元的支持、再塑及修復作用減弱，導致更多神經細胞的變性甚至死亡，進而進一步加重腦功能障礙。由于AS為永久性細胞且人腦內神經干細胞的數量少、分布局限，AS的自我更新、修復能力遠不能滿足臨床自我修復治療的需要，因此干細胞或AS移植在進行組織修復與功能重建中有重要的臨床意義，被認為是治療腦血管疾病最有前途的治療方法之一，成為當前神經科學家和臨床醫生研究的焦點。然而，截止到目前，常被臨床及實驗室用于細胞移植治療的胚胎干細胞和骨髓基質細胞等干細胞因涉及臨床來源和倫理等方面的問題，使其深入研究受到了極大的限制；ADSC具有體內含量豐富，臨床易于取材，分離純化方法簡便，誘導反應易于操作、安全，自體移植無倫理問題等特點，引起了研究者的廣泛關注。

本研究證明，ADSC可在體外培養及分化。經DE-1誘導劑干預，誘導分化的星形膠質細胞具有明顯的細胞突起，胞體、胞核外觀圓形，胞核居中，可見到1-2個核仁。分化第7 d至14 d，細胞的鏡下形態已基本發育成熟。免疫組化結果顯示，該時間點所檢測到的GFAP陽性表達率也均達到高峰，提示細胞分化成熟。前期的大量結果顯示，在這種化學誘導反應的第7 d時所獲得的細胞，已經具有了正常星形膠質細胞的膜電位等電生理功能[9-13]。然而，如果繼續延長細胞分化時間，細胞衰老現象逐漸顯現，胞體不飽滿，突起回縮變短，數量減少，甚至消失，死亡的細胞數量明顯增加。同時，本研究的MTT法和流式細胞術分析結果顯示，隨著誘導時間逐漸延長，誘導至14 d時的細胞存活率已明顯低于7 d存活率。因此，我們可以得出結論，應用IBMX誘導的星形膠質細胞可在體外存活3周，在誘導的第7天獲得的星形膠質細胞的數量最多，效率最高，此時即可以終止這種誘導反應。但細胞存活率隨誘導時間逐漸下降。細胞凋亡是造成誘導過程中細胞死亡的主要因素。因此，尋找導致細胞死亡的原因及機制可以延長分化后細胞存活時間，為今后開展進一步藥物篩選、臨床細胞移植提供更為足量的種子細胞。