反相高效液相色譜法測定尼爾雌醇原料及片劑的有關物質和含量

孫 婷 ，張 菁 ，劉 云 ，姜建國 ，王 柳 ，喬曉寧

（1.河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊 050011； 2.河北省石家莊市食品藥品檢驗中心，河北 石家莊 050011）

尼爾雌醇又名維尼安，化學名為3－（環戊氧基）－19－去甲 －17－孕甾 －1，3，5（10）－三烯 －20－炔 －16α，17α－二醇，是我國自行研制的新型雌激素，為雌三醇衍生物，具有口服長效和強效的優點[1]，常用于圍絕經期婦女雌激素替代治療[2]。常用外用制劑主要有尼爾雌醇片、尼爾雌醇陰道用凝膠劑[3]。目前，尼爾雌醇原料及片劑的現行質量標準收載于2015年版《中國藥典（二部）》，原料質量標準項下雖然設置了有關物質檢查項，但采用的方法為薄層色譜法[4]；片劑質量標準項下則未設置安全性指標有關物質檢查項，且鮮見尼爾雌醇有關物質的測定方法報道。本研究中參考文獻[5－16]，建立了反相高效液相色譜（RP－HPLC）法測定尼爾雌醇原料及片劑的有關物質和含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：20AT型高效液相色譜儀（島津公司）；1260型高效液相色譜儀（安捷倫公司）；XS205型電子天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo公司），MCM36型電子天平（百萬分之一，德國Sartorius公司）。

試藥：尼爾雌醇對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為 100239－200702，純度為 99.4% ，80℃減壓干燥 2 h后使用）；尼爾雌醇原料藥（LJ公司，批號為N20170323，純度為 99.5% ）；尼爾雌醇片（廠家 A，批號分別為 170711，170712，170713，規格為每片 1 mg）；乙腈為色譜純（Fisher公司）；乙酸銨為分析純（天津市科密歐試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.02 mol／L 乙酸銨溶液 － 乙腈（40 ∶60，V／V），等度洗脫；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL。在此色譜條件下，尼爾雌醇保留時間約為16 min，理論板數按尼爾雌醇峰計為9 277，與相鄰峰分離度為2.38，符合要求。詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

供試品溶液（含量測定）：取尼爾雌醇原料10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加入流動相適量，振搖，溶解后用流動相稀釋至刻度，即得尼爾雌醇原料供試品溶液；取尼爾雌醇片細粉適量（約相當于尼爾雌醇10mg），精密稱定，置100 mL容量瓶中，同法操作，取續濾液，作為尼爾雌醇片供試品溶液。

對照品溶液：精密稱取尼爾雌醇對照品適量，同法操作，制備同濃度溶液，作為對照品溶液。

有關物質供試品溶液：取尼爾雌醇原料10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加入流動相適量，振搖，溶解后用流動相稀釋至刻度，即得尼爾雌醇原料供試品溶液；取尼爾雌醇片細粉適量（約相當于尼爾雌醇10 mg），精密稱定，置10 mL容量瓶中，同法操作，取續濾液，作為尼爾雌醇片供試品溶液。

對照溶液：分別精密量取上述供試品溶液適量，用流動相溶解并稀釋至0.01 g／L，即得自身對照溶液。

空白輔料溶液：取按尼爾雌醇片處方比例的輔料適量，按供試品溶液制備方法制備，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得空白輔料溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取尼爾雌醇原料約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，進行不同條件下的降解試驗。1）酸破壞試驗，加2 mol／L鹽酸溶液1 mL，搖勻，室溫放置10 min后，用2 mol／L氫氧化鈉溶液調至中性。2）堿破壞試驗，加2 mol／L氫氧化鈉溶液1 mL，搖勻，室溫放置10 min后，用2 mol／L鹽酸溶液調至中性。3）氧化破壞試驗，加入30%過氧化氫溶液2 mL，搖勻，室溫放置1 h。4）光照破壞試驗，在紫外燈（4 500 lx）下照射 24 h。5）高溫破壞試驗，在150℃下加熱3 h。分別加流動相稀釋至刻度，按擬訂色譜條件測定，結果見圖2。可見，經過破壞產生的降解物質與主峰完全分離，且主成分和主要降解產物在280 nm檢測波長處均有吸收，說明擬訂色譜條件能準確檢測出樣品中可能存在的相關雜質。

穩定性考察：量取2.2項下有關物質供試品溶液（質量濃度為1 g／L），每隔2 h依法進樣測定峰面積，單個最大雜質峰面積的 RSD為1.78%（n＝5），總雜質峰面積和的 RSD為 1.69%（n＝5），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

檢測限和定量限確定：對2.2項下對照品溶液進行逐級稀釋，按擬訂色譜條件進樣分析。當信噪比（S／N）為 3∶1時，測得的檢測限為 56 ng／mL；當信噪比（S／N）為10∶1時，測得的定量限為187 ng／mL。

線性關系考察：取質量濃度分別為 0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00，2.00 g ／L 的系列對照品溶液進樣測定，以峰面積（A）為縱坐標、以質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 A＝9.591 6×108C ＋2.482 3×106，r＝0.999 9（n＝8）。結果表明，尼爾雌醇質量濃度在0.01～2.0 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取2.2項下對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的 RSD為0.34%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：分別精密量取2.2項下供試品溶液（含量測定用，批號為170711）適量，分別于室溫下放置0，1，2，4，6，8，12 h 時，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為 0.53%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內穩定性良好。

圖2 不同降解條件下尼爾雌醇的HPLC色譜圖

加樣回收試驗：分別取已知含量的樣品（批號為170711）100 mg，精密稱定，共 9份，各置 10 mL容量瓶中，分別加入低、中、高質量濃度的尼爾雌醇，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 尼爾雌醇加樣回收試驗結果（n＝9）

2.4 尼爾雌醇有關物質及含量測定

取本品20片，精密稱定，研細，取細粉適量，精密稱定，分別按2.2項下方法制備含量測定用供試品溶液、對照品溶液、有關物質測定用供試品溶液及對照溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結果見表2。

表2 各批樣品含量及有關物質測定結果（%）

3 討論

流動相選擇：國外藥典中均未收載尼爾雌醇原料及片劑的質量標準，而文獻[3]中的色譜條件無法使有關雜質達到準確檢出，且流動相中未含有易揮發的緩沖鹽，不利于雜質的結構分析。故本研究建立的方法在色譜條件中加入易揮發的醋酸銨，在擬訂色譜條件下，不僅雜質和樣品能檢出并有效分離，而且能對該樣品進行定量分析。

檢測波長選擇：對供試品溶液在200～400 nm波長范圍內進行紫外最大吸收掃描，發現尼爾雌醇的最大吸收波長為280 nm，且在該檢測波長下，尼爾雌醇的降解雜質及尼爾雌醇響應值基本一致，均能有效檢出。

色譜柱耐用性：不同廠家的色譜柱的檢測結果在相對保留時間上略有不同，但主峰與已知雜質及未知雜質分離度均能滿足完全分離要求，且按尼爾雌醇峰計，理論板數均大于6 000，峰純度良好。

有關物質檢測：尼爾雌醇片劑現行標準中，未設置有關物質檢查項，尼爾雌醇原料質量標準中，雖設置了有關物質檢查項，但采用方法為靈敏度較低的薄層色譜法，無法準確對尼爾雌醇有關物質進行準確定性定量研究。文獻[5]中，僅考察了尼爾雌醇的含量檢測方法。對其有關物質的研究方面呈空白狀態。因此，本研究中建立了尼爾雌醇片有關物質檢查項，并統一了尼爾雌醇原料及片劑的有關物質檢測方法，即節省了檢驗資源，又為該品種的安全性把控提供了依據。

有關物質降解情況：由圖2可見，尼爾雌醇在酸堿、高溫破壞條件下，雜質變化較大；在光照破壞條件下，雜質變化較小，且該雜質有待于定性研究。

綜上所述，所建立的等度洗脫RP－HPLC法能同時測定尼爾雌醇原料及片劑的有關物質和含量，且能為尼爾雌醇原料及片劑質量標準的改進提供技術支持。