蜜蜂腸道菌群概述（續(xù)）

張棋麟 吳杰 李還原 董志祥 苗春輝 王劉豪 郭軍 李繼蓮│文

1 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500；2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京100093；3 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，蒙自 661101

（續(xù)《中國蜂業(yè)》2019年第1期）

三、蜜蜂腸道菌群的分布

1.蜜囊

蜜囊（圖1, 2）是腸道內(nèi)的一種肌肉質(zhì)的可膨脹器官，以適應(yīng)采集蜂采集花蜜。雖然蜜囊經(jīng)常含有營養(yǎng)豐富的花蜜并可作為微生物的能量來源，染色結(jié)果表明蜜囊內(nèi)幾乎不包含有細(xì)菌，但其他學(xué)者從蜜囊中分離出13種乳酸菌和部分雙歧桿菌菌株，這些細(xì)菌可能是來自花蜜而非蜜蜂體內(nèi)共生的菌群。蜜囊這種頻繁的填充和排空采集的花蜜到蜂箱中可擾亂微生物群落結(jié)構(gòu)并阻止其他細(xì)菌定殖。

2.中腸

中腸（圖1, 2）是蜜蜂消化道中最大的器官，中腸中三種主要共生菌（即Beta，F(xiàn)irm-5和Gamma-1，簡稱BFG）只占BFG微生物總數(shù)的1%～4%。由于中腸上皮細(xì)胞可產(chǎn)生圍食膜，圍食膜是一種松散的薄膜可以輔助消化，保護(hù)上皮細(xì)胞以防粗糙的食物粒子。中腸上皮細(xì)胞可連續(xù)生產(chǎn)這種膜狀物并在食物通過時脫落，這樣可以阻止微生物附著。因此，消化酶和圍食膜的存在可以解釋中腸中腸道菌比較貧瘠的原因。顯微檢測結(jié)果表明大多數(shù)中腸細(xì)菌都處于較后的位置，靠近幽門部，表明中腸的部分微生物可能在解剖切割中腸時從回腸轉(zhuǎn)入到中腸后部。

圖1 蜜蜂不同腸部位解剖圖

圖2 蜜蜂腸道菌群在不同腸道部位的分布

3.回腸

西方蜜蜂的回腸（圖1, 2）是在中腸和直腸之間的相對較小的器官，它具有較深的內(nèi)折以便提供表面區(qū)域來吸收未被中腸收集的營養(yǎng)。回腸中Beta種系型的細(xì)菌一層的粘附在臨近的宿主腸道組織上，Gamma-1 種系型的細(xì)菌厚厚的分布在臨近Beta細(xì)菌和回腸壁附近，盡管中腸比回腸大，但回腸中BFG的群體數(shù)量幾乎比中腸大量兩倍（占總BFG的5%～10%）。與中腸相比，回腸的內(nèi)膜折疊中具有豐富的附著點(diǎn)，使其有機(jī)會接觸一些消化而未被吸收的營養(yǎng)。

4.直腸

直腸（圖2）像蜜囊一樣，具有一定的膨脹性，可適應(yīng)更大的容量；這發(fā)生于工蜂連續(xù)保留消化廢物直到它們飛出箱外排泄飛行時。在這相對靜態(tài)的環(huán)境下，類似于白蟻的胃，直腸的內(nèi)容物（主要是空的花粉外壁）可為細(xì)菌提供營養(yǎng)來源，發(fā)現(xiàn)花粉壁的碳水化合物很難被蜜蜂消化。由于直腸營養(yǎng)豐富的環(huán)境，其中棲息著大部分始終穩(wěn)定的微生物，F(xiàn)irm-5種系型是直腸中的優(yōu)勢種群，在直腸內(nèi)腔中普遍存在，并散布于消化的花粉外殼上。

四、蜜蜂腸道益生菌的分離、功能和應(yīng)用前景

傳統(tǒng)的微生物學(xué)研究依賴于純化分離單個微生物的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，主要基于描述這些微生物的代謝、生化和形態(tài)特征。然而不能在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)的微生物，或在尚未被發(fā)現(xiàn)的特殊條件下才能被培養(yǎng)，分子測序技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一問題?；诜肿由飳W(xué)和最新的測序技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)蜜蜂腸道微生物中占主導(dǎo)地位的細(xì)菌只有八大類，部分類別已經(jīng)鑒定到種，最新測序方法的研究結(jié)果顯示出蜜蜂腸道中容易培養(yǎng)、完全好氧的生物體只占腸道微生物中的很少一部分，這與傳統(tǒng)培養(yǎng)手段的研究結(jié)果完全不一致。隨著對蜜蜂腸道菌群多樣性信息的不斷掌握，研究的重點(diǎn)將逐步過渡到細(xì)菌功能尤其是菌株水平的細(xì)菌功能的研究，因此，單菌株的分離培養(yǎng)顯得尤為重要。利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段已成功培養(yǎng)出蜜蜂腸道中的優(yōu)勢菌或新發(fā)現(xiàn)種。通過將效率較低的細(xì)菌培養(yǎng)菌群分析方法和分子生物學(xué)工具結(jié)合，將會加快推進(jìn)蜜蜂微生物相關(guān)的研究。

腸道微生物的發(fā)展史告訴我們，過去幾十年培養(yǎng)為主時代，不能很好系統(tǒng)解析腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能；近10年由于二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，非培養(yǎng)條件下高通量測序技術(shù)的使用，使得人們在腸道微生物組成、結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性增加了前所未有的認(rèn)知。

1.蜜蜂腸道細(xì)菌人工培養(yǎng)

蜜蜂腸道微生物群落的研究最早可追溯到20世紀(jì)初。研究人員對來自蜜蜂腸道和蜂巢的生物體的培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行研究，記錄各種代謝和功能活動。利用細(xì)菌培養(yǎng)的方法，研究者從蜜蜂腸道中觀察到6000多種細(xì)菌菌株，然而，很多觀察結(jié)果存在前后矛盾的現(xiàn)象。此外，早期對蜜蜂腸道微生物的研究主要集中在對西方蜜蜂巢脾中致病菌的鑒定上，而共生微生物很少受到重視。研究表明，從特定環(huán)境中培養(yǎng)的微生物只是實(shí)際棲息在這一環(huán)境中的很小一部分，通常在特定的棲息環(huán)境下只有1%的細(xì)菌可以培養(yǎng)，在特殊的培養(yǎng)基和環(huán)境條件下，較多的有機(jī)體可能生長，但從大多數(shù)環(huán)境中采集的微生物樣品很多都無法在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行培養(yǎng)，許多微生物不能在實(shí)驗(yàn)室里培養(yǎng)，或在尚未被發(fā)現(xiàn)的特殊條件下才能培養(yǎng)，直到分子測序技術(shù)的出現(xiàn)才解決了這一問題。

最新的研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂腸道細(xì)菌大部分都是厭氧或兼性厭氧菌，這也是最新研究方法所得結(jié)論與傳統(tǒng)有氧純培養(yǎng)方法不一致的主要原因。人工培養(yǎng)的方法可能可使感興趣的微生物的分離成為可能，進(jìn)一步描述其化學(xué)和形態(tài)特征，并開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.蜜蜂腸道菌群的功能

（1）蜜蜂腸道菌群的營養(yǎng)及代謝功能

腸道菌群在營養(yǎng)供給、消化及吸收上起到了至關(guān)重要的作用，并通過這種方式影響宿主的發(fā)育和健康。研究表明腸道共生菌可為宿主提供氨基酸、維生素B以及固醇等營養(yǎng)物質(zhì)，并參與物質(zhì)代謝作用及合成作用。利用宏基因組分析方法，研究人員預(yù)測了蜜蜂八大類腸道共生菌之一的Alpha-1含有維生素B12的合成系統(tǒng)，可能為蜜蜂合成維生素。蜜蜂共生菌可將花粉轉(zhuǎn)化為蜂糧，蜂糧比花粉含有更多的維生素、更少的多糖以及不同的氨基酸，這些營養(yǎng)成分的變化很可能是共生的乳酸菌（乳酸菌）群參與轉(zhuǎn)化而成，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)也證實(shí)Gilliamella、Lactobacillus和Bifidobacterium等蜜蜂腸道內(nèi)的共生菌具有合成果膠降解酶、糖苷水解酶和多糖水解酶等降解碳水化合物的功能，并從基因水平上證明Lactobacillus和Bifidobacterium等組成的乳酸菌菌群參與蜂蜜的釀造和糖類物質(zhì)的代謝。

腸道菌群還具有潛在的食物解毒功能，由于很多來源的營養(yǎng)只有在無毒性的條件下才有效，并且一些分子的水解作用如一些植物細(xì)胞壁成分既具有解毒作用，也能使食物成為有效的營養(yǎng)來源。很多昆蟲特化為以某些有毒植物為食，其腸道菌可能在消化和解毒這些來源的食物上發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，G. apicola菌能利用一些對蜜蜂有害的單糖，通過對從蜜蜂和熊蜂腸道中分離的42株G. apicola進(jìn)行基因組測序和分析發(fā)現(xiàn)，該菌代謝某些有毒碳水化合物的能力與各自擁有的降解途徑直接相關(guān)，但在相當(dāng)程度上菌株利用碳水化合物的范圍存在差異，G. apicola可能是蜜蜂腸道中調(diào)節(jié)營養(yǎng)的一個重要菌群，并影響著宿主健康。

醋酸菌科的共生菌多種多樣，可為昆蟲提供營養(yǎng)、有利于昆蟲的發(fā)育和組織的形成， 還能調(diào)控免疫，它們在昆蟲腸道總中比較常見，也能從唾液腺和生殖組織中分離得到。醋酸菌科的細(xì)菌在蜜蜂腸道內(nèi)主要為Alpha-1 和Alpha-2。Alpha-2又分為Alpha-2.1和Alpha-2.2。Alpha 2.2分離自蜜蜂腸道。Corby-Harris等（2014）基于PCR擴(kuò)增的焦磷酸測序法表明Alpha 2.2和其他一些細(xì)菌如Lactobacillus kunkeei，可棲息于哺育蜂蜜囊、咽下腺以及王漿中，但Alpha 2.2在蜜蜂中腸和后腸中幾乎不存在。Alpha 2.2存在于蜂糧中，采集蜂的蜜囊里及幼蟲體內(nèi)，但在哺育蜂和采集蜂的中腸和后腸中的含量微乎其微，可能與蜜蜂對花粉的消化有關(guān)。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明蜜蜂體內(nèi)的Alpha 2.2這一細(xì)菌對蜜蜂具有獨(dú)特的特性，通過與上顎腺分泌物一起促進(jìn)蜂群內(nèi)的蜂子發(fā)育，Alpha 2.2細(xì)菌不屬于腸道細(xì)菌，但在蜜囊-上顎腺-王漿-幼蟲這一生態(tài)位中具有較豐富的含量，并通過哺育蜂的哺育行為傳播給發(fā)育的蜂子。

最新研究還發(fā)現(xiàn)，蜜蜂的腸道菌群通過影響宿主的卵黃生成素、胰島素信號以及味覺反應(yīng)等一系列細(xì)菌代謝和激素信號的傳導(dǎo)來促進(jìn)宿主體重增加；此外，還通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸以及附著于腸壁上在腸道內(nèi)形成一個氧化梯度，顯著降低腸道pH和氧化還原電勢；代謝分析揭示腸道細(xì)菌降解花粉中的植物聚合物，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物影響宿主的營養(yǎng)。

（2）蜜蜂腸道菌群的防御及保護(hù)功能

在昆蟲生命周期的所有階段中，都會受到許多捕食者、寄生蟲、擬寄生物以及病原體的威脅。一些膜翅目昆蟲的生活和攝食方式使它們更易受到病原體侵?jǐn)_，社會性昆蟲的大規(guī)模的群居生活也增加了病原體感染的風(fēng)險(xiǎn)和同種個體之間疾病的傳播。當(dāng)昆蟲面臨眾多的寄生蟲和致病菌威脅時，能夠通過共生菌群的屏蔽作用與疾病進(jìn)行對抗并通過這些途徑對機(jī)體進(jìn)行保護(hù)。如切葉蟻、獨(dú)居的泥蜂、蜜蜂和熊蜂等除了自身防御應(yīng)對這些威脅外，均有一些共生菌群參與到保護(hù)宿主與細(xì)菌的相互作用中；還有些昆蟲通過共生菌產(chǎn)生的毒素來抵抗寄生蜂從而對昆蟲進(jìn)行保護(hù)。

環(huán)境壓力可導(dǎo)致微生物群落生態(tài)失調(diào)，并進(jìn)一步引起宿主對疾病的易感性。一項(xiàng)對來自CCD的蜂群和正常蜂群的成年西方蜜蜂工蜂的腸道菌群的調(diào)查表明，未受CCD感染的正常蜂群主要以厚壁菌門細(xì)菌和一種變形菌門細(xì)菌定殖為主，CCD感染的蜂群則檢測到較高的γ-變形菌門細(xì)菌。這可能與腸道菌的生態(tài)失調(diào)有關(guān)，從而導(dǎo)致一些功能喪失，造成對蜂群健康狀態(tài)的負(fù)面作用。另有研究表明，當(dāng)對蜜蜂幼蟲飼喂含有組成不同的乳酸菌和雙歧桿菌的混合共生菌時，在免疫反應(yīng)觀察中發(fā)現(xiàn)一個類似幼蟲芽孢桿菌感染時出現(xiàn)的免疫反應(yīng)，表明這些共生細(xì)菌可用來預(yù)防或治療自然的病原體。一些細(xì)菌菌株在體外表現(xiàn)出對幼蟲芽孢桿菌直接的拮抗作用，并在另一項(xiàng)研究中也證實(shí)具有一定的抑制活性。但對這種宿主和共生菌之間相互作用和動態(tài)變化還需要進(jìn)一步的研究。

近年來，蜂群衰竭失調(diào)（CCD）現(xiàn)象的發(fā)生導(dǎo)致美國，歐洲和日本等國蜜蜂數(shù)量嚴(yán)重下降，眾多影響蜜蜂健康的因素是對養(yǎng)蜂產(chǎn)業(yè)的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。然而，健康蜂群的維持可能離不開腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，由于益生菌可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗菌肽和防御素，增強(qiáng)宿主的免疫能力，從而提高其對病原菌的抵抗能力，目前已提出作為蜜蜂幼蟲抵抗幼蟲芽孢桿菌的重要益生菌，很可能成為養(yǎng)蜂中常用的化學(xué)處理的一個合適替代品。

（3）腸道菌群與蜜蜂壽命相關(guān)聯(lián)

最新研究表明，蜂王在衰老過程中的腸道菌群處于變化之中，隨著年齡的增長，更加長壽的蜂王的腸道菌群表現(xiàn)出顯著不同的變化。在壽命較短的工蜂的腸道菌群中，衰老導(dǎo)致變形菌門增加，乳桿菌屬及雙歧桿菌屬缺失，并與一系列宿主衰老標(biāo)志物的變化一致；通過對63只蜂王的2個年齡時期的消化道中4個生態(tài)位的菌群進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)：隨著年齡的增長，每個消化道生態(tài)位中有至少2個細(xì)菌物種發(fā)生顯著變化；而與工蜂相比，更加長壽的蜂王在衰老過程中，乳桿菌屬及雙歧桿菌屬顯著增加，變形菌門顯著缺失。

3.蜜蜂腸道益生菌的發(fā)展前景

蜜蜂腸道細(xì)菌菌群受到抗生素、病害等外界因素的影響，有益細(xì)菌的數(shù)量也隨著日齡的增加不斷減少。當(dāng)前，抗生素的大量使用，使蜜蜂腸道內(nèi)一些特定功能的益生菌遭到嚴(yán)重的破壞，從而造成蜜蜂對疾病的抵抗力越來越低，并產(chǎn)生一定的抗藥性，蜜蜂的健康也面臨著嚴(yán)重的威脅。目前，有關(guān)蜜蜂腸道菌群的研究剛起步，科研人員在弄清腸道菌群的種類、特征和多樣性基礎(chǔ)上，不斷挖掘這些腸道細(xì)菌的功能。只有在弄清其功能之后，才能進(jìn)一步開發(fā)更加有效的抗菌或益生菌產(chǎn)品。一些發(fā)達(dá)國家已經(jīng)認(rèn)識到以使用乳酸菌為代表的免疫療法，并開始運(yùn)用到養(yǎng)蜂生產(chǎn)中。例如，通常乳酸菌的活力極弱，只能在相對受限制的環(huán)境中存活，一旦脫離這些環(huán)境，自身會遭到滅亡，只有經(jīng)過特殊工藝處理的乳酸菌才能到達(dá)腸道，進(jìn)入蜜蜂腸道的細(xì)菌必須具備數(shù)量多、活力強(qiáng)的特性才能發(fā)揮較好的益生功能。