5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究

劉自然，霍東升，賈建新，楊占君

(包頭醫學院解剖教研室，內蒙古 包頭 014000)

現代生活中，腦血管疾病具有高發病率，高致殘率，高死亡率的特點，嚴重危害人類的健康[1]。急性缺血性腦血管病治療的關鍵是早期疏通阻塞血管， 目前證實的有效治療是靜脈注射重組組織型纖溶酶原激活劑溶栓[2]。但該治療方法僅僅對于那些缺血時間在6 h內的病人有效，治療獲益有時間依賴性，其治療效果仍有較大的提升空間[3]。腦缺血區再灌注血流會引起腦組織細胞的損傷和功能障礙，因此，防治腦缺血再灌注損傷就顯得極為重要。

羅丹寧衍生物具有廣泛的藥理活性。通過對雜環的修飾，可有抗凋亡，抗菌，抗病毒，抗炎，抗氧化等作用[4]。前期課題組已證實，5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)具有良好的抗帕金森病作用[5]。本研究通過線栓法制備腦缺血再灌注損傷大鼠模型，對模型大鼠神經功能缺損癥狀評分用Longa5分法，檢測腦梗死體積用TTC染色法，檢測SOD，GSH-Px活性，MDA含量，以及Bcl-2，Bax，caspase-3蛋白的表達水平，以探討羅丹寧對腦缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠(240～260 g)144只，購于河北醫科大學解剖教研室，生產許可證號[SCXK(冀)2016-1-003]，使用許可證號[SYXK(冀)2016-24]，合格證號：1202176。本研究經內蒙古科技大學包頭醫學院實驗動物倫理委員會批準(包院字20181120)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

RD-1(北京友誼眾生生物科技有限公司)，尼莫地平(江蘇康緣藥業股份有限公司，每片60 mg，批號170401)，TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)(Sigma公司，美國，批號T8160)，超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所，批號A001)，谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，批號A005)，丙二醛(MDA)(南京建成生物工程研究所，批號A003)，Bcl-2抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AA112-2)，Bax抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AB026-2)，Caspase-3抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AC030-2)，β-actin抗體(碧云天生物科技有限公司，批號AA128-2)，兔抗鼠IgG(北京諾博萊德科技有限公司，批號NRPA24-10)。

TDL-40B型離心機(上海安亨科學儀器廠)，Max-M5型酶標儀(美國Molecular Devices公司)，恒溫水浴鍋(天津泰斯特凈化設備有限公司)，分光光度計(美國Beckman Coulter公司)，Mini Protean 3 cell電泳儀(電泳)(美國Bio-Rad公司)，DYCZ-24DN電泳系統(轉膜)(上海醫療儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型制備、實驗分組及給藥

大鼠適應性飼養一周后，術前12 h禁食,不禁水,參照Longa法[6]制成大鼠大腦中動脈缺血模型。大鼠麻醉后,仰臥位固定于手術臺上，頸部剪毛,碘伏消毒,右側頸部旁正中線一做縱行切口，依次切開皮膚、皮下組織和頸闊肌,分離右側頸總動脈，以及頸內動脈，及頸外動脈，結扎頸總動脈近心端，從頸外動脈或頸總動脈插入栓線，經頸內動脈進入大腦中動脈，栓線插入深度約為20 mm。缺血2 h后，輕輕提拉所留線頭至略有阻力，實現大腦中動脈再灌注，造模完成。

大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型制作成功后，隨機分為5組，假手術組(Sham group)為1組，共6組，每組6只。分別為：模型組(MCAO group)：灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液；陽性對照組：灌胃給予尼莫地平(Nimodipine)(10 mg/kg)；RD-1低劑量組(RD-1-L group)：灌胃給予RD-1 5 mg/kg；RD-1中劑量組(RD-1-M)：灌胃給予RD-1 10 mg/kg；RD-1高劑量組(RD-1-H group)：灌胃給予RD-1 20 mg/kg；假手術組(Sham)：灌胃給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。各組大鼠連續給藥14 d。

1.3.2 神經行為學評分及腦梗死體積測定

恢復血液再灌注24小時以后，參照Longa 5級4分制評分原則：①0分，正常，無神經系統異常的體征。②1分，不能完全伸展病變對側上肢。③2分，行走時向對側旋轉。④3分，行走時向對側傾倒。⑤4分，無自發活動伴意識降低。得1～4分者為成功模型。術中意外死亡、再灌注24 h內死亡、蛛網膜下腔出血的大鼠被剔除并隨機補充。

模型成功的大鼠斷頭取腦，置于-20℃冰箱冰凍約10 min，然后將腦組織間隔2 mm冠狀切5刀，切成6個大腦連續的冠狀切面。然后將大腦切片置于5 mL含1%TTC的PBS溶液中，在37℃恒溫箱內避光孵育，約30 min，間隔10 min將大腦切片翻動一次。取出腦片放入4%多聚甲酵中固定后拍照保存，應用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件處理并作統計，計算每張腦片的梗死面積并根據腦片厚度計算相對梗死體積。

1.3.3 腦組織氧化因子檢測

取各組大鼠大腦缺血側大腦皮層組織，以 1 g∶9 mL 的比例加入冰生理鹽水，制成 10%的腦勻漿液。置于 4℃離心機 2500 r/min 離心 15 min，取上清液。按各個試劑盒說明書中的操作說明進行檢測腦組織SOD，GSH-Px活性及MDA含量。

1.3.4 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測相關凋亡蛋白的表達

取大鼠腦組織加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液，低溫下制備腦組織勻漿，4℃離心后取上清，用BCA法測總蛋白濃度，以20 μg總蛋白上樣，10%分離膠電泳后轉膜至硝酸纖維素膜上，經5%脫脂牛奶封閉，漂洗等步驟后，一抗Bcl-2(1∶1000)、Bax(1∶1000)、caspase-3(1∶1000)室溫孵育2 h，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2000)室溫孵育1 h，化學發光試劑顯色后，曝光拍照，利用Image J進行圖像灰度值處理。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 羅丹寧對大鼠神經行為學評分及腦梗死體積比的影響

術后對各組大鼠用藥后1、3、7和14 d進行評分。初時(1～3 d)明顯觀察到術后模型成功的大鼠有健側前肢屈曲和肢體肌無力，自由運動時不能直線行走，向健側轉圈，嚴重者會向患側傾倒。假手術大鼠未顯示出神經損傷的跡象。 隨著時間的延長，各組大鼠均恢復，但與假手術組比較，模型組術后各時段神經功能缺損評分仍顯著增高，且損傷較重。(P<0.05)。各給藥組大鼠與模型組大鼠評分差異無統計學意義。 第14天，RD-1低、中、高劑量組大鼠的評分顯著低于模型組(P<0.05)，陽性藥物尼莫地平也對模型組神經損傷的恢復作用有顯著影響。(P<0.05)。與假手術組比較，模型組腦梗死體積明顯增加(P<0.05)。 與模型組比較，經RD-1治療14天后，腦梗死體積明顯減小，缺血性損傷得到緩解。通過對MCAO模型大鼠神經功能評分和腦梗死體積測定的綜合判斷，發現持續給予RD-1 14 d可顯著改善腦缺血再灌注損傷，減少神經功能缺損評分，減少腦梗死體積，起到很好的神經保護作用。(圖1、圖2)

2.2 RD-1對大鼠腦組織抗氧化作用大的影響

模型組腦組織中SOD和GSH-PX活性降低，MDA含量升高。 與假手術組比較，有顯著性差異(P<0.05),與模型組比較,除腦組織GSH-Px含量RD-1中劑量組無顯著性變化外(P>0.05), 其它各組大鼠腦組織中SOD和GSH-PX活性均顯著升高，但MDA含量明顯降低(P<0.05)，提示RD-1可降低大鼠腦組織氧化應激水平。(圖3)

注：圖中四組bar依次代表各組大鼠用藥后1、3、7和14 d評分情況，與假手術組組比較，*P <0.05，與模型組組比較，#P <0.05。圖1 RD-1對MCAO模型大鼠神經功能評分的影響Note. The four groups of bars in the figure represent the scores of rats in each group at 1, 3, 7 and 14 days after treatment. Compared with Sham group, *P<0.05. Compared with MCAO group, #P<0.05.Figure 1 Effect of RD-1 on neurological function scores in MCAO model rats

注：A：假手術組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術組比較，*P <0.05。與模型組比較，#P <0.05。圖2 RD-1對MCAO模型大鼠腦梗死體積比的影響Note. A：Sham group,B：MCAO group,C：RD-1-L group,D：RD-1-M group,E：RD-1-H,F：Nimodipine group. Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 2 Effect of RD-1 on the volume ratio of cerebral infarction in MCAO model rats

注：A：假手術組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術組組比較，*P <0.05。與模型組組比較，#P <0.05。圖3 RD-1對MCAO模型大鼠腦組織抗氧化作用的影響Note. A：Sham group,B：MCAO group,C：RD-1-L group,D：RD-1-M group,E：RD-1-H,F：Nimodipine group.Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 3 Effect of RD-1 on the antioxidation in brain tissue in MCAO model rats

2.3 RD-1對大鼠腦組織神經元凋亡相關蛋白表達水平的影響

Western blot結果顯示，與假手術組比較，MCAO組Bcl-2表達顯著降低，Bax和caspase-3表達顯著增高(P<0.05)。 與MCAO組相比，尼莫地平組和RD-1低，中，高劑量組Bcl-2水平顯著升高，Bax和caspase-3水平顯著降低(P<0.05)，提示RD-1可通過影響細胞中Bcl-2，Bax和caspase-3的水平影響細胞凋亡。進而達到腦缺血再灌注后神經元保護的目的。

3 討論

在本研究中，通過線栓建立大鼠大腦中動脈閉塞模型，并在缺血2 h后再灌注。連續給藥14 d后，進行一系列行為學測試和梗塞體積計算以評估RD-1抗腦缺血再灌注損傷作用的藥效學效應。建立腦缺血再灌注損傷動物模型是進行缺血性腦病實驗的基礎，栓線制備大鼠腦缺血再灌注模型[7]。因其損傷小，操作簡便，缺血部位恒定，可準確控制缺血和再灌注時間等特點得到國內外廣泛的應用[8-13],評分從功能角度反映腦缺血的病理損傷，梗死體積評價了腦缺血造成的組織損傷，目前應用較多的大鼠神經損傷嚴重程度評分標準可以對大鼠進行全面綜合的評價，分數越高表明損傷越嚴重。與假手術組比較，模型組神經評分和腦梗死體積明顯增加。RD-1藥物組與模型組相比，神經評分和腦梗死體積明顯減少，提示RD-1能改善模型大鼠的神經功能缺損癥狀，降低腦梗死體積比。表明RD-1對大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。

注：A：假手術組,B：模型組,C：低劑量組,D：中劑量組,E：高劑量組,F：尼莫地平組。與假手術組組比較，*P <0.05。與模型組組比較，#P <0.05。圖4 RD-1對MCAO模型大鼠神經元細胞凋亡的影響(±s,n=6)Note. A：Sham group，B：MCAO group，C：RD-1-L group，D：RD-1-M group，E：RD-1-H，F：Nimodipine group.Compared with Sham group,*P <0.05.Compared with MCAO group，#P <0.05.Figure 4 Effect of RD-1 on neuronal apoptosis in MCAO model rats

腦缺血再灌注可產生大量的氧自由基。 神經組織本身缺乏抗氧化物質，富含對氧自由基敏感的多不飽和脂肪酸。 因此，腦細胞最容易受到氧自由基的攻擊[14]。SOD廣泛存在于各種生物體中，是清除氧自由基中最重要的抗氧化酶; GSH-Px催化過氧化氫分解形成水和氧化的GSH，為維持其正常的結構和功能，從而防止細胞氧化損傷。 MDA是脂質過氧化的最終產物，可間接反映細胞受到自由基攻擊的嚴重程度[15]。本研究中，RD-1各劑量組大鼠腦組織SOD和GSH-Px活性顯著升高，MDA含量顯著降低，說明RD-1具有降低氧化應激水平的作用。

腦缺血再灌注損傷過程中，神經細胞以凋亡為主要死亡方式，Bcl-2家族發揮了極為關鍵的調控作用，可以減低凋亡水平，相反，促凋亡蛋白Bax通過破壞線粒體膜的完整性，并激活caspase級聯反應，誘導凋亡[16]。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax和caspase-3蛋白表達明顯升高，RD-1給藥后，各個劑量組均能明顯降低Bax和caspase-3蛋白表達水平，并升高Bcl-2蛋白的表達，提示RD-1有抑制神經細胞凋亡的作用。

綜上所述，5-(4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基)羅丹寧(RD-1)對腦缺血再灌注損傷具有良好的神經保護作用，其作用機制涉及減輕線粒體損傷，清除氧自由基，抑制神經元凋亡；抑制細胞外鈣離子內流和細胞內鈣離子釋放來防止細胞內鈣離子超載所致的平滑肌收縮作用，降低興奮性氨基酸毒性作用[17]；抑制神經元興奮性，降低能量的消耗，促進神經功能恢復。從而達到改善受損動物的神經功能障礙。