單學(xué)時(shí)完成PCR與瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)的探索

楊柯金

(河南省南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 南陽(yáng) 473061)

1 目前存在的問(wèn)題

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)與瓊脂糖電泳是分子生物學(xué)和基因工程實(shí)驗(yàn)中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)[1,2]。一次實(shí)驗(yàn)課的課時(shí)為1～3學(xué)時(shí)(45min～2h)，常規(guī)PCR反應(yīng)至少需要1.5～2h；瓊脂糖電泳中制膠、制樣、點(diǎn)樣、電泳等過(guò)程至少需要1h；實(shí)驗(yàn)原理、操作步驟的講述、學(xué)生動(dòng)手操作、結(jié)果點(diǎn)評(píng)等過(guò)程至少需1h；總體一次PCR與瓊脂糖電泳實(shí)驗(yàn)需要4h，無(wú)法滿(mǎn)足教學(xué)需要。

2 問(wèn)題解決途徑

通過(guò)改良PCR反應(yīng)體系、縮短儀器運(yùn)行及電泳時(shí)間，從而做到在單學(xué)時(shí)內(nèi)順利完成PCR及電泳實(shí)驗(yàn)，以便教師有足夠的時(shí)間可充分解釋實(shí)驗(yàn)原理、總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助學(xué)生提高分析、解決問(wèn)題的能力，滿(mǎn)足PCR與電泳實(shí)驗(yàn)的教學(xué)需求，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。

2.1 改良PCR反應(yīng)體系，減少加樣種類(lèi) 常規(guī)PCR反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)緩沖液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、一對(duì)引物、模板DNA、 H2O，反應(yīng)需加7種試劑。本實(shí)驗(yàn)選用2×EasyTaq? PCR SuperMix試劑，該試劑包括了PCR擴(kuò)增所需的反應(yīng)緩沖液、Mg2+、 dNTP、 Taq DNA聚合酶4種試劑，用表1反應(yīng)體系、只需要加4種試劑，縮短了加樣過(guò)程，更方便學(xué)生操作。

2.2 減小擴(kuò)增目的片段的大小，縮短單次循環(huán)反應(yīng)時(shí)間 吊蘭是常見(jiàn)的室內(nèi)觀賞植物，實(shí)驗(yàn)用吊蘭基因組DNA(gDNA)作模板，取材方便。用吊蘭gDNA做模板，引物序列(表1)參考于典司博士論文[3]，擴(kuò)增出來(lái)的DNA總長(zhǎng)315bp。由于擴(kuò)增的片斷較小，變性、退火、延伸時(shí)間均由原來(lái)的30～60s降低為10s(表2)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后均可發(fā)現(xiàn)明亮、單一擴(kuò)增條帶(圖1A—1D)，表明該實(shí)驗(yàn)參數(shù)可用于基因片段的擴(kuò)增。

表1 PCR反應(yīng)體系

(注： 引物F： AGGTCTTTTTCCCTGTATCC，引物R： GATTGGCTTTCCATTTACTG)

表2 PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)

2.3 降低循環(huán)圈數(shù)，縮短總體反應(yīng)時(shí)間 PCR循環(huán)圈數(shù)也是影響反應(yīng)時(shí)間的一個(gè)關(guān)鍵因素，常規(guī)的循環(huán)圈數(shù)為35～40，通過(guò)設(shè)置20、 25、 30、 35、 40個(gè)不同的循環(huán)圈數(shù)，發(fā)現(xiàn)循環(huán)圈數(shù)為20時(shí)，24min即可完成PCR擴(kuò)增，且經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物條帶明亮(圖1A—1D, 1)，可滿(mǎn)足學(xué)生實(shí)驗(yàn)的需求。

2.4 增大電壓、縮短電泳時(shí)間 瓊脂糖電泳電壓要求為3～5V/cm，用150V電壓，分別電泳5、 10、 15、 20min(圖1)，發(fā)現(xiàn)，電泳10min后DNA marker中的100bp、 250bp、 500bp的條帶可明顯區(qū)分開(kāi)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)擴(kuò)增的片段為315bp，界于250～500bp之間，電泳10min足夠用來(lái)觀察條帶，判斷其位置(圖1B)。

2.5 染料加入瓊脂糖凝膠中，省略染色過(guò)程 常用的染色步驟有兩種： 一種是先電泳，后染色；一種是將染料放入瓊脂糖凝膠中，邊電泳邊染色。常用的DNA染料為EB, EB為強(qiáng)誘變劑，具有高致癌性，本實(shí)驗(yàn)選用相對(duì)較安全的染料GelRed，采用將該染料加入瓊脂糖凝膠中的方法進(jìn)行DNA染色，既相對(duì)安全，又節(jié)省了時(shí)間。

圖1 不同循環(huán)環(huán)數(shù)、不同電泳時(shí)間PCR產(chǎn)物(注： A～D分別為電泳5min (A)、電泳10min (B)、電泳15min (C)、電泳20min (D)結(jié)果；1～5分別為PCR循環(huán)圈數(shù)20、 25、 30、 35、 40的PCR產(chǎn)物；M為T(mén)rans2K? Plus Ⅱ DNA Marker)。

3 教學(xué)反思

通過(guò)以上改良，選用表1的反應(yīng)體系、選用表2的反應(yīng)參數(shù)，用GelRed做染料加入瓊脂糖凝膠中，150V電泳10min，最終可以在34min完成PCR反應(yīng)及電泳實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果可滿(mǎn)足學(xué)生實(shí)驗(yàn)。

在快速完成該實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，以下幾個(gè)問(wèn)題值得關(guān)注： 首先，PCR實(shí)驗(yàn)中需要不同量程的微量移液器，該裝備價(jià)格相對(duì)較高，且如果使用不當(dāng)，極易損耗，如何讓每一位學(xué)生都能正確、熟練運(yùn)用微量移液器是一個(gè)值得探究的問(wèn)題；其次，本實(shí)驗(yàn)中需要2×EasyTaq? PCR SuperMix和毒性相對(duì)小的GelRed為DNA染料，該染料價(jià)位相對(duì)較高，必使實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)增加；最后，該實(shí)驗(yàn)操作步驟較多，學(xué)生是否具有較強(qiáng)的動(dòng)手能力也是影響本實(shí)驗(yàn)在有效時(shí)間內(nèi)順利完成的一個(gè)關(guān)鍵因素，如何在有限的時(shí)間內(nèi)提高學(xué)生的動(dòng)手能力是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。

(基金項(xiàng)目： 河南省高等教育教學(xué)改革研究與實(shí)踐項(xiàng)目“網(wǎng)絡(luò)時(shí)代地方高師院校生科師范生教師專(zhuān)業(yè)實(shí)踐能力培養(yǎng)的研究與實(shí)踐”，No.2017SJGLX425)

*前文受翰思科學(xué)儀器公司關(guān)注*