電針夾脊穴對坐骨神經慢性壓迫性損傷模型大鼠針刺鎮痛的后效應研究

余文英，李瑜芝，黃明愉，吳倩雯，黃 華，林 棟，林麗莉

（福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350122）

神經病理性疼痛是一個持續的過程，病程反復，嚴重影響著患者的生活質量。目前神經性病理性疼痛的治療在臨床上主要以藥物控制為主，緩解癥狀的同時也帶來諸多的毒副作用。近年來研究表明，針刺是治療各種疼痛，特別是神經病理性疼痛的有效手段，電針鎮痛不僅存在即刻效應，而且擁有著特殊的針刺后效應［1-3］。而現代醫學認為“夾脊”穴與神經系統、免疫系統和組織的生理病理均密切相關，大量研究已經證實夾脊穴在治療慢性疼痛上的效果明確［4-6］。環磷腺苷效應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是一種核轉錄因子，研究表明神經損傷后導致的CREB磷酸化是神經病理性疼痛形成和維持的重要機制［7］。因此本項目組基于脊髓背角細胞效應的角度，觀察脊髓背角細胞CREB蛋白的表達情況，分析針刺后鎮痛效應可能的作用機制，并進一步探析產生鎮痛效應的最佳時間，為規范性臨床操作提供科學的理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量220～280 g，購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。實驗期間大鼠自由進食飲水，室溫控制在（25±2）℃，光暗周期12／12 h。

1.2 實驗試劑 CREB抗體（武漢三鷹生物技術有限公司）；β-actin抗體（美國 Cell Signaling公司）；HRP鼠抗兔IgG抗體（南京諾維贊生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 超聲波細胞粉碎儀（美國SONICS公司）；Infinite M200 PRO全自動酶標儀（瑞士TECAN公司）；ChemiDoc XRS＋化學發光成像分析系統（美國BIO-RAD公司）；華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；電熱恒溫槽（上海華進醫療器械有限公司）。

2 實驗方法

2.1 大鼠熱痛閾的測定 將大鼠置于黑色布袋中，頭部在前，尾部在后，露出布袋外，待大鼠安靜后開始測量。測試時間為上午8：00-12：00，將大鼠尾部中下1／3部分浸燙50℃的熱水中，以其甩尾時間作為痛閾值，用秒表計時。每只以5 min為間隔，共測試3次，取其平均值。所有實驗大鼠在入組前均接受熱痛閾測定，并剔除熱痛閾小于2 s或者大于10 s痛覺異常的大鼠，各組大鼠干預前及干預后均進行熱痛閾測定。

2.2 造模與分組 適應性喂養1周后進行熱痛閾篩選，并剔除痛覺異常大鼠，采用隨機數字表法將SD大鼠分為空白組、模型組、電針后即刻組、電針后0.5 h組、電針后1 h組、電針后2 h組、電針后4 h組、電針后12 h組及電針后24 h組各6只。模型組和電針組參照 Bennett和 Xie［8］的造模方法：大鼠手術造模前1天給予禁食不禁水，用10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔注射以麻醉。麻醉成功后，在大鼠右腿后側中部施行備皮、消毒、鋪無菌巾，剪開術區皮膚約2 cm，鈍性分離肌肉，充分暴露右側坐骨神經中段。用4-0的鉻制腸線給予疏松單結結扎4次，每1 mm為一個間隔，松緊度以不影響坐骨神經血液循環和右后肢肌肉出現輕微抖動為標準，結扎線可以在坐骨神經主干上滑動。最后在傷口予青霉素鈉鹽粉預防感染，縫合皮膚。造模完成后，按照每籠3只進行飼養，麻醉清醒后自由攝食飲水，密切觀察生命體征和傷口愈合情況。

2.3 干預方法 電針組大鼠固定于特制鼠籠，使之頭尾稍可活動，但身體不可轉動，于造模后第7天開始電針治療。參照《實驗針灸學》［9］定位雙側L3～L5夾脊穴，在脊柱旁約0.3 cm處，選用環球牌0.30 mm×25 mm針灸針，直刺進針約2.5 mm。接通電針，參數為：疏密波，2 Hz，1 mA，電針 1 次，留針20 min，強度以大鼠肢體輕微顫動，但不出現掙扎為準。空白組和模型組大鼠不予任何干預措施，僅固定20 min。

2.4 取材 各電針組分別于電針后即刻、0.5、1、2、4、12、24 h進行取材，空白組與模型組固定20 min后即刻取材。以10%水合氯醛（4 mL／kg）腹腔麻醉大鼠，腹腔面朝上固定，打開胸腔，暴露心臟。灌注用針頭自左心室插入主動脈，固定針頭，剪開右心耳。用200 mL注射器注入0.9%NaCl沖洗血管后，用手術剪刀在大鼠背部正中線剪開皮膚，分離脊柱兩側肌肉，暴露出胸、腰、骶段脊柱，先游離坐骨神經至椎管處，再剪開椎板暴露脊髓，用玻璃分離針挑開脊膜，最后迅速將脊髓剪下，截取脊髓腰膨大（L4～L6節段脊髓），迅速丟入液氮中，待脊髓全部取出，即刻移入－80℃冰箱保存備用。

2.5 觀察指標及方法

2.5.1 大鼠熱痛閾值測定 檢測9組大鼠干預前與干預后熱痛閾值。

2.5.2 Western Blot法檢測CREB蛋白的表達

裂解蛋白后進行BCA蛋白定量，取30 μg蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，進行SDS-PAGE電泳，將表達產物電轉移至PVDF膜上。在封閉液中封閉1～2 h后，TBST中清洗 10 min，加入 CREB一抗（1∶5 000）、β-actin 一抗（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜。次日，TBST清洗3遍，每遍10 min，加入二抗（1∶10 000），室溫搖床孵育 1 h。 TBST 清洗 4 遍，每遍5 min，于超高靈敏度化學發光成像系統中顯影成像。采用Bio-Rad圖像分析軟件對條帶進行灰度值分析，以目的蛋白與內參蛋白的比值作為目的蛋白的表達值。

2.6 統計學方法 實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料符合正態性分布以（）表示，多組樣本比較采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 電針干預前后熱痛閾值的改變 見表1。

表1 各組大鼠熱痛閾值比較（）s

表1 各組大鼠熱痛閾值比較（）s

注：與空白組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01；與干預前比較，5） P＜0.05，6） P＜0.01。

組別空白組模型組電針后即刻組電針后0.5 h組電針后1 h組電針后2 h組電針后4 h組電針后12 h組電針后24 h組干預后6.00±0.27 4.56±0.321）5.00±0.512）5.50±0.423）5）5.50±0.634）5）5.94±0.624）5）5.89±0.374）6）4.56±0.501）4.28±0.231）n666666666干預前5.78±0.50 4.22±0.311）4.67±0.331）4.22±0.601）4.22±0.371）4.17±0.171）4.17±0.371）4.22±0.311）4.33±0.331）

3.2 9組大鼠脊髓背角CREB蛋白表達比較 見圖 1、圖 2。

圖1 9組大鼠脊髓背角細胞CREB蛋白電泳圖

圖2 9組大鼠脊髓背角細胞CREB蛋白表達比較

4 討 論

自Bennett和Xie第一次運用機械痛閾和熱痛閾來評價坐骨神經慢性壓迫性損傷（CCI）模型以來，CCI模型已經被廣泛運用于神經病理性疼痛的造模中。CCI模型的表現與人體周圍神經損傷造成的慢性神經痛極為相似［10］，故本課題亦采用CCI模型作為實驗的研究模型。電針治病的機理主要是在特定的經絡穴位上針刺并施以不同電頻持續不斷地刺激穴位。大量臨床與基礎實驗研究均證實電針在鎮痛方面的顯著療效［11-14］。從傳統醫學來看，夾脊穴作為人體背部重要的經外奇穴，其不僅入腦，與人體各陽經相匯相通，乃陽脈之海，總督人體一身之陽。現代醫學認為，夾脊穴位于人體脊神經的出入口，其解剖位置與神經系統、免疫系統息息相關。因此不管是從傳統醫學還是現代醫學角度，電針夾脊穴均具有鎮痛的理論依據。故本研究以CCI模型為基礎，以電針夾脊穴為主要手段，觀察大鼠在電針干預前后熱痛閾值的變化。既往對于針刺鎮痛即刻效應的解釋多是應用閘門控制學說［15］，然而并不足以解釋說明針刺鎮痛較長持續時間的后續效應。雖然針刺鎮痛的相關研究已經深入分子水平，但仍以電針的即刻效應為主，涉及其鎮痛后效應的研究仍在少數，故本課題擬從脊髓背角細胞中CREB蛋白不同時間點（電針后即刻、0.5、1、2、4、12、24 h）表達變化的角度，試圖從分子的角度探討電針鎮痛后效應的規律。

CREB蛋白作為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）下游的重要轉錄因子之一，是一種真核生物細胞核內的調控因子，早期在神經元再生、突觸形成及學習記憶等領域的作用被研究者們廣泛關注和證實［16］；隨著研究的深入，學者們逐漸發現記憶與中樞敏化之間的不可分割性［17］。前期實驗研究已經證實中樞敏化是疼痛產生的重要機制之一［18-20］。故近年來CREB在鎮痛上的作用也逐漸被研究者們挖掘出來，已有研究表明，神經病理性痛和炎癥痛均可上調脊髓背角CREB的表達［21-22］，CREB可能是參與維持疼痛的重要因子之一［23-25］。熱痛閾作為疼痛評價的一個相對客觀的行為學檢測指標，在疼痛模型中已經被廣泛認可使用。本研究發現CCI造模后大鼠熱痛閾值明顯低于空白組（P＜0.01），同時脊髓背角CREB表達量明顯提高（P＜0.01）。可見電針鎮痛效應的機制可能是下調脊髓背角CREB蛋白的表達。

針灸作用的時效性包括即時效應和針刺后效應，起針后仍存在效應稱為針刺后效應。隨著針刺鎮痛后效應的提出，有學者猜測針灸的時效性與西藥半衰期指導患者用藥頻率、用藥劑量等存在相通之處。已有眾多學者對針刺鎮痛后效應進行研究，張慧等［26］對偏頭痛患者進行疼痛強度數字等級量表評分，發現自針刺5 min起鎮痛即開始起效，認為鎮痛效應可以維持在針刺后8 h。陳瑾等［27］以急性佐劑性關節炎（AA）大鼠作為炎癥痛模型，針刺昆侖穴，觀察即時及后效應，研究結果發現針刺存在明顯的后效應，至少持續30 min以上。趙倉煥等［28］認為電針對AA的鎮痛效應可以持續12 h。實驗組前期研究也已經發現電針夾脊穴可以發揮鎮痛效應，其鎮痛效應至少在2 h以上［29］。本研究發現：與模型組比較，電針后0.5 h組、電針后1 h組、電針后2 h組及電針后4 h組熱痛閾明顯提高（P＜0.01，P＜0.05），電針后即刻組、電針后 0.5 h 組、電針后 2 h組 CREB表達明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。

本研究結果表明，電針夾脊穴具有即時鎮痛效應和針刺鎮痛的后效應。這可能是通過下調脊髓背角細胞CREB蛋白的表達來發揮鎮痛效應，并且其鎮痛效應可以維持4 h以上，電針后12 h鎮痛效應較差。今后本課題組將進一步開展觀察CREB上游或者下游蛋白的表達情況，增加后續效應更多時間點的研究，尤其是針刺后4～12 h時間段，以進一步闡述電針鎮痛及其可能的后效應機制。