五羥色胺對大鼠舌下神經放電活性的影響

湯 思 周秀芳 胡 克 熊夢清 胡衛華 董明林

阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征(obstructive sleep apnea syndrome，OSAS)是一種常見的睡眠呼吸障礙性疾病，主要病理生理特征是在夜間反復發生上氣道狹窄或塌陷、頻發間歇低氧和覺醒[1]。頦舌肌是上氣道主要的伸舌肌，吸氣時頦舌肌收縮能保持氣道開放，頦舌肌功能障礙是引起上氣道塌陷的重要原因，而舌下神經運動神經元(hypoglossal motor nuclei，HMN)通過舌下神經支配頦舌肌[2]。目前OSAS治療的金標準是持續正壓通氣，但患者的依從性不高(17%～54%),藥物治療一直受到重視，并有望成為治療新手段[3,4]。五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是一種重要的神經遞質，在多種病理生理活動中發揮作用。研究顯示慢性間歇低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)大鼠頦舌肌的放電活性受到外周不同劑量5-HT受體配體的影響，本研究擬探討中樞舌下神經運動核中 5-HT的濃度變化對CIH大鼠舌下神經放電活性的影響[5]。

材料與方法

1.實驗動物：8 周齡 SPF 級雄性成年 Sprague-Dawley 大鼠30只，體重150～180g，購自湖北省動物實驗中心。將大鼠隨機分為常氧組和CIH 組，前者分為常氧對照組和生理鹽水組，后者分為CIH對照組、5-HT(1mmol/L)組、5-HT(10mmol/L)組、5-HT(100mmol/L)組。CIH組大鼠接受CIH處理，其中CIH對照組不注射任何試劑，5-HT(1mmol/L)組、5-HT(10mmol/L)組以及5-HT(100mmol/L)組分別在在HMN注射20μl相應濃度5-HT溶液，再記錄舌下神經放電活性。常氧組中的對照組不注射任何試劑，生理鹽水組則在HMN注射等量生理鹽水。所有實驗均在武漢大學人民醫院動物實驗中心完成。

2.實驗試劑：五羥色胺鹽酸鹽購自美國 Sigma-Aldrich 公司，用生理鹽水配置成1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L 3個濃度備用。

3.CIH 動物模型的建立：按照我們已建立的方法進行[6]。CIH 組大鼠飼養于常壓間歇低氧動物箱中進行CIH處理，每一循環周期 90s，其中低氧 30s(FiO28%)，復氧 60s(FiO221%)，每天8h，連續4周。常氧組大鼠在相同時間段放入同等規格動物箱內，同等穩定溫濕度條件，輸入空氣。正式實驗前進行急性間歇低氧(acute intermittent hypoxia，AIH)處理，每次5min，連續3次。

4.HMN定位注射：根據Paxinos & Watson 圖譜查找SD大鼠HMN坐標(顱骨下8.70mm、中線旁0.40mm、距前囟13.68mm)。大鼠以10%烏拉坦(10ml/kg) 腹腔注射麻醉后，進行氣管插管和雙側迷走神經離斷；俯臥位固定于腦立體定位儀上，縱向剪開頭皮，找到腦部前囪。標記前囟的三軸坐標后，用打孔鉆在顱骨標記處打孔；最后根據記下的坐標值再次移動到定位點，通過微量注射器將相應試劑注射到HMN。

5.舌下神經分離及電信號記錄：按照我們已建立的方法進行[7]。將大鼠仰臥放置于恒溫臺上，鈍性分離大鼠一側舌下神經(與注射部位同側)并立即浸泡于溫液體石蠟中，在玻璃分針的幫助下輕輕將舌下神經懸掛于雙極銀電極上。以多導生理記錄儀(Power Lab)記錄和分析舌下神經電信號，設置帶通100～10000Hz，時間常數 50ms。常氧組和CIH對照組在記錄舌下神經放信號前均進行AIH處理，不同劑量5-HT組在間歇缺氧和注射試劑后開始記錄。

6.腦組織切片 HE 染色：處死大鼠后用多聚甲醛灌流并取出腦組織，進行包埋切片和 HE 染色。在電子顯微鏡下觀察 HMN 微量注射留下的痕跡，根據解剖位置確認微量注射部位是否為 HMN。

結 果

1.腦定位注射部位組織學:圖1為大鼠腦定位注射后的冠狀位切片HE染色，可見微量注射針從小腦進入第四腦室和到達HMN的痕跡，借助大鼠腦定位圖譜可確定注射部位為HMN。

圖1 腦定位注射部位冠狀位切面(HE，×100)

2.常氧組舌下神經放電活性比較:常氧對照組和生理鹽水組大鼠舌下神經放電活性比較，差異無統計學意義(表1、圖2、圖3)，60min時兩組大鼠舌下神經放電振幅分別為25.53±2.29μV 和25.08±1.28μV，放電頻率分別為71.60±8.17Hz和70.40±4.98Hz，P均>0.05，提示在 HMN 注射生理鹽水對舌下神經放電活性無明顯影響。

表1 各組舌下神經放電振幅變化

與常氧對照組比較,*P=0.000;與CIH對照組比較,*P<0.05;與5-HT(1mmol/L)組比較,ΔP<0.05;與5-HT(10mmol/L)組比較,▲P<0.05

3.CIH 對照組與常氧對照組舌下神經放電活性比較：常氧對照組大鼠在15min、30min、 45min和60min時舌下神經放電振幅分別為25.58±2.41μV、25.78±1.68μV、24.60±3.38μV、25.53±2.29μV，CIH 對照組分別為36.97±2.02μV、38.27±3.26μV、33.74±3.53μV、35.49±6.85μV(表1、圖2)，后者在各時間點放電振幅均高于前者，差異均有統計學意義(P=0.000)。如圖3所示，CIH對照組在各時間點的放電頻率均高于常氧對照組，差異有統計學意義(P=0.000)。60min 整合圖(圖4)可見 CIH 對照組舌下神經放電振幅明顯高于常氧對照組，表明 CIH 可誘導舌下神經放電活性持續增強，時間可達 60min，呈易化現象。

圖2 各組舌下神經放電振幅比較與常氧對照組比較,#P=0.000;與CIH對照組比較,*P<0.05;與5-HT(1mmol/L)組比較,ΔP<0.05;與5-HT(10mmol/L)組比較,▲P<0.05

圖3 各組舌下神經放電頻率比較與常氧對照組比較，#P=0.000

圖4 各組舌下神經放電活性的整合圖

4.HMN 中不同濃度 5-HT 對 CIH 組大鼠舌下神經放電活性的影響：CIH 組大鼠在 HMN 分別注射 20μl 不同濃度(1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L)5-HT 后，舌下神經放電活性均有增強，且放電振幅隨5-HT 濃度而逐漸增強(圖4)。如表1和圖2所示，不同組別大鼠在各時間點放電振幅依次增大，5-HT(1mmol/L)組大鼠舌下神經放電振幅平均于 30min 時達峰，5-HT(10mmol/L)組平均于 22min 時達峰，5-HT(100mmol/L)組平均于 15min 時達峰。5-HT(10mmol/L)組和5-HT(100mmol/L)組的放電振幅均顯著高于 CIH 對照組(P<0.05)，但5-HT(1mmol/L)組與 CIH 對照組比較，差異無統計學意義。5-HT(100mmol/L)組大鼠舌下神經放電振幅均大于 5-HT(10mmol/L)組，但只在 15min和30min時差異有統計學意義(P<0.05)。CIH 各組間舌下神經放電頻率比較，差異無統計學意義(圖4)。

討 論

本研究結果發現，大鼠在經 CIH 處理后，舌下神經放電振幅和放電頻率均高于常氧組，表明 CIH 可誘導舌下神經放電活性的增強，且可持續 60min，呈現出一種神經可塑性，這與以往的研究結果一致。同時，不少實驗也證明，CIH 能逐步增強舌下神經/上氣道肌肉、膈神經/膈肌、頸動脈竇神經的放電反應性。

對經 CIH 處理大鼠的 HMN 微量注射不同濃度(1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L)的 5-HT 后發現，1mmol/L 5-HT 即能引起舌下神經放電振幅改變，且放電振幅隨5-HT 的濃度增高而增強，表明在 HMN 注射 5-HT 可增強舌下神經放電活性，且一定范圍內 5-HT 劑量與舌下神經放電活性呈量效關系。5-HT 是一種重要的神經遞質，涉及許多功能，包括睡眠、情感、學習和記憶等。目前認為 5-HT 也參與 OSAS 的發生，包括調節睡眠/覺醒周期和影響睡眠結構、呼吸控制和頦舌肌收縮[9，10]。筆者在以前的實驗中發現外周 5-HT 能增強舌下神經放電活性，且由 5-HT2A 受體激活的 PKC途徑介導，本實驗筆者發現中樞HMN中的5-HT也調節舌下神經的放電活性[11]。

諸多研究表明，間歇缺氧誘導的舌下神經放電活性增強依賴 5-HT 系統。首先，5-HT 本身能興奮呼吸[12]。其次，CIH 能增加舌下神經核尾部腹中側 5-HT 含量，其機制可能與 CIH 能使舌下神經核中神經纖維 5-HT 濃度增加有關，也可能與CIH 可致舌下神經核產生新的 5-HT 末端膨大有關[13]。此外，間歇缺氧可刺激延髓中縫 5-HT 能神經元，使相關呼吸運動神經元池釋放 5-HT[14]。本實驗結果顯示，CIH 可增強舌下神經放電活性，增加 HMN 中5-HT 的濃度能導致舌下神經放電活性進一步增強，這與上述結果相一致。

但在本實驗中，舌下神經的放電頻率并沒有因5-HT 的濃度改變而改變，這可能與舌下神經放電振幅和頻率是由不同的神經機制控制有關。舌下神經放電振幅由呼吸運動池控制，而放電頻率則由產生呼吸節律的腦干網絡或通向節律中心的傳入通路調控[15]。Berner等[16]發現頻率調控可能與 P 物質相關，缺乏 P 物質的轉基因小鼠不出現頻率長時程易化現象。

總之，本實驗發現，對 CIH 大鼠 HMN 給予 5-HT 能增強舌下神經的放電活性，提示 5-HT 可能有利于 OSAS 患者上氣道的開放，為藥物治療 OSAS提供了思路。