結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)假陰性影響因素回歸分析

梁麗麗 呂婭敏 馬 蕓 劉 新 孫書貞 張國龍

我國是世界上結(jié)核病負(fù)擔(dān)最重的6個(gè)國家之一，僅次于印度、印度尼西亞。2010年我國第5次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示,15歲及以上人口中活動(dòng)性肺結(jié)核患病率為459/10萬，患者高達(dá)499萬(471萬～527萬)，涂陽肺結(jié)核患者有72萬(58萬～86萬)[1]。2015年全球估計(jì)共有1040萬例新發(fā)結(jié)核病例。在這1040萬新發(fā)病例中，檢出和正式通報(bào)病例僅有610萬例，遺漏病例高達(dá)430萬例。結(jié)核病早期診斷仍是全球面臨的重大挑戰(zhàn)[2]。快速、準(zhǔn)確、及時(shí)地診斷結(jié)核病成為控制結(jié)核病疫情的關(guān)鍵。

近年來發(fā)展起來的γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assays,IGRAs)為結(jié)核病的診斷提供了新途徑，它是用產(chǎn)生γ-干擾素(IFN-γ)的T淋巴細(xì)胞是否對結(jié)核分枝桿菌特異性抗原有記憶，來判斷機(jī)體是否感染過結(jié)核分枝桿菌。國內(nèi)外研究表明IGRAs對活動(dòng)性結(jié)核病診斷的綜合敏感度為85%～90%，綜合特異性為85%～97%[3，4]。IGRAs檢測方法目前常用的試劑盒包括QuantiFERON-TB Gold test(QFT)、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)和結(jié)核分枝桿菌感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)，其中T-SPOT.TB被認(rèn)為是檢測T淋巴細(xì)胞反應(yīng)敏感度和特異性最高的方法，其檢測僅需采集5～6ml靜脈血，體外培育24h即可得到結(jié)果[5]。雖然T-SPOT.TB對活動(dòng)結(jié)核病的診斷有很高的特異性，但其作為一種體外結(jié)核病診斷方法，仍不能完全排除假陰性。目前對于T-SPOT.TB假陰性檢測結(jié)果進(jìn)行深入分析的研究并不多見,故本研究擬通過分析224例T-SPOT.TB結(jié)果為陰性的活動(dòng)性結(jié)核病患者的臨床資料，并與同期收治的253例T-SPOT.TB結(jié)果為陽性的活動(dòng)性結(jié)核患者進(jìn)行比較，以期尋找與T-SPOT.TB結(jié)果假陰性結(jié)果相關(guān)的獨(dú)立影響因素，進(jìn)而為今后臨床的輔助診斷提供一定的思路。

對象與方法

1.對象：回顧性分析2016年1月～2017年9月河南省胸科醫(yī)院和河南省人民醫(yī)院診治的、臨床或?qū)嶒?yàn)室診斷為活動(dòng)性結(jié)核病的初治患者1760例。納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)WHO的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中確診活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)為：痰/其他標(biāo)本TB-DNA陽性者或培養(yǎng)結(jié)果為結(jié)核桿菌[6]；臨床診斷為活動(dòng)性結(jié)核病的標(biāo)準(zhǔn)為：臨床表現(xiàn)和影像學(xué)表現(xiàn)支持結(jié)核，且抗結(jié)核治療有效。根據(jù)T-SPOT.TB檢測結(jié)果分為兩組，即陰性組224例，陽性組1536例。為減少實(shí)驗(yàn)室誤差及兩組因兩組樣本量差別大引起的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏差，最終選擇同天入組的477例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。陰性組224例，其中男性151例，女性73例，患者年齡11～89歲，中位年齡為50歲。TB-DNA陽性或結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的患者148例，臨床診斷結(jié)核76例。陽性組253例，其中男性157例，女性96例，患者年齡8～89歲，中位年齡為36歲。TB-DNA陽性或結(jié)核菌培養(yǎng)陽性的患者186例，臨床診斷67例。所有病例人免疫缺陷病毒(HIV)檢測均為陰性，無妊娠或免疫抑制劑用藥史。

2.T-SPOT.TB檢測：所有患者均在抗結(jié)核治療前行T-SPOT.TB檢測，采用T-SPOT.TB試劑盒(英國Oxford Immunotech公司，批號：TEC053921) 并嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采集靜脈血4～6ml，肝素抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，將濃度調(diào)整為2.5×106/ml的細(xì)胞懸液。每例測試樣本需要4個(gè)檢測孔：無血清的細(xì)胞培養(yǎng)液作為陰性對照，植物血凝素(PHA)作為陽性對照，特異性抗原ESAT-6和CFP-10作為刺激抗原，每孔加入100μl細(xì)胞懸液(即每孔加入的細(xì)胞數(shù)為25萬個(gè))，將培養(yǎng)板放在含有37℃，5%CO2，濕度適中的的培養(yǎng)箱中孵育16～20h。加入酶標(biāo)二抗后再于2～8℃孵育1h，洗板后每孔加50μl顯色液室溫避光反應(yīng)7min，蒸餾水終止反應(yīng)，干燥后使用顯微鏡進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)。并按照說明書的判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：首先對回顧性研究結(jié)果進(jìn)行單因素Logistic回歸分析，選取差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和臨床意義的因素再進(jìn)行多因素的Logistic回歸分析，最后確定與T-SPOT.TB結(jié)果假陰性相關(guān)的獨(dú)立影響因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用調(diào)整的比值比(OR) 及95% 的可信區(qū)間(CI) 估計(jì)各因素與T-SPOT.TB結(jié)果假陰性的聯(lián)系強(qiáng)度。

結(jié) 果

1.臨床病例情況：在224例T-SPOT.TB陰性組結(jié)核病患者中，肺外結(jié)核4例(淋巴結(jié)結(jié)核4例)，肺結(jié)核207例(肺組織結(jié)核134例，結(jié)核性胸膜炎10例，肺組織結(jié)核合并氣管結(jié)核33例，肺組織結(jié)核合并胸膜結(jié)核30例)，肺結(jié)核合并肺外結(jié)核患者13例(肺結(jié)核合并淋巴結(jié)結(jié)核3例，肺結(jié)核合并胸壁結(jié)核10例)。在253例陽性組結(jié)核病患者中，肺外結(jié)核5例(淋巴結(jié)結(jié)核5例)，肺結(jié)核219例(肺組織結(jié)核169例，結(jié)核性胸膜炎20例，肺組織結(jié)核合并氣管結(jié)核16例，肺組織結(jié)核合并胸膜結(jié)核11例，肺組織結(jié)核合并氣管、胸膜結(jié)核3例)，肺結(jié)核合并肺外結(jié)核29例(肺結(jié)核合并結(jié)核性腹膜炎7例，肺結(jié)核合并胸壁結(jié)核5例，肺結(jié)核合并淋巴結(jié)結(jié)核5例，肺結(jié)核合并結(jié)核性腦膜腦炎5例，肺結(jié)核合并骨關(guān)節(jié)結(jié)核4例，肺結(jié)核合并腹腔、骨關(guān)節(jié)結(jié)核1例，肺結(jié)核合并腹腔、腸結(jié)核2例)。兩組患者的基本資料見表1。

2.單因素Logistic回歸分析:變量賦值表見表2。采用單因素Logistic分析分別研究各指標(biāo)與假陰性的相關(guān)性，結(jié)果顯示年齡(OR=1.046，95% CI：1.034～1.059)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(OR=0.231，95% CI：0.162～0.330)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(OR=0.281，95% CI：0.162～0.488)對假陰性的影響可能存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是假陰性的保護(hù)因素，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)越高，發(fā)生假陰性的可能性越低。年齡是假陰性的危險(xiǎn)因素，年齡每增加1歲，假陰性的風(fēng)險(xiǎn)增加0.046倍。性別、ESR、WBC等其他因素對假陰性的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單因素Logistic回歸分析T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的危險(xiǎn)因素見表3。

表1 兩組患者基本資料

3.多因素Logistic回歸分析：為了消除混雜因素的干擾，同時(shí)剔除掉單因素分析中無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的性別因素，進(jìn)一步分析各危險(xiǎn)因素之間的真實(shí)效應(yīng)。以是否假陰性為因變量，單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的年齡、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)為自變量，進(jìn)行二元Logistic逐步回歸分析，納入和排除標(biāo)準(zhǔn)為0.05和0.10。患者年齡(OR=1.045，95% CI：1.031～1.059)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(OR=0.242，95% CI：0.164～0.356)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(OR=0.254，95% CI：0.134～0.480), 可以認(rèn)為年齡、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)是假陰性的獨(dú)立影響因素(表4)。患者年齡每增加1歲，出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)增加0.045倍，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)每升高1×109/L，出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)降低0.242倍，單核細(xì)胞計(jì)數(shù)每升高1×109/L，出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)降低0.254倍。

表2 多因素Logistic回歸分析變量賦值表

表3 T-SPOT.TB結(jié)果假陰性危險(xiǎn)因素的單因素Logistic回歸分析

表4 T-SPOT.TB結(jié)果假陰性影響因素的多因素Logistic回歸分析

討 論

目前診斷結(jié)核病的方法主要有涂片染色法、結(jié)核菌培養(yǎng)法、分子基因生物學(xué)方法等，但這些檢查都需要有足夠量的標(biāo)本才能進(jìn)行。而臨床工作中很多情況下無法獲得充足的標(biāo)本，成為了制約結(jié)核病診斷的瓶頸。IGRAs由于只需血液標(biāo)本就能進(jìn)行檢測，在缺少標(biāo)本導(dǎo)致無法進(jìn)行病原學(xué)檢測時(shí)，可作為活動(dòng)性結(jié)核的輔助診斷方法，尤其對于肺外結(jié)核的診斷有很大意義。國內(nèi)外研究表明IGRAs對活動(dòng)性結(jié)核病診斷的敏感度為85%(95% CI: 84%～86%)，特異性為84%(95% CI:83%～85%)，與本研究中T-SPOT.TB診斷活動(dòng)性結(jié)核病的敏感度(87.3%,1536/1760)相似[3,6]。

IGRAs檢測陰性結(jié)果表示盡管對照抗原刺激后T細(xì)胞分泌正常，但結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后IFN-γ產(chǎn)生不足或不產(chǎn)生。理論上表明受試者體內(nèi)沒有結(jié)核分枝桿菌特異性抗原致敏的T淋巴細(xì)胞，也就代表受試者未感染結(jié)核分枝桿菌。因?yàn)橛胁糠旨訇幮越Y(jié)果的存在，在臨床工作中常導(dǎo)致結(jié)核診斷的延誤和錯(cuò)判。

結(jié)核分枝桿菌感染人體后，細(xì)胞免疫開始發(fā)揮作用。巨噬細(xì)胞分泌MHCⅡ類抗原遞呈并與有αβ-T細(xì)胞受體的未定型CD4Th細(xì)胞前體結(jié)合，巨噬細(xì)胞分泌的IL-12促進(jìn)幼稚型CD4T淋巴細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，后者分泌IFN-γ。在此過程的任一細(xì)胞出現(xiàn)功能減低，都會(huì)造成IFN-γ分泌減少，從而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。以往文獻(xiàn)報(bào)道，T-SPOT.TB雖然有很高的陰性預(yù)測值,但實(shí)際上其檢測結(jié)果可能會(huì)受到藥物(環(huán)氧化酶抑制劑、T細(xì)胞活化抑制劑)、HLA分型等影響[7～10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，對于結(jié)核患者，224例假陰性組病例的患者平均年齡為50歲，顯著高于253例陽性組病例的患者平均年齡36歲。曾有文獻(xiàn)證實(shí)隨著年齡的增長，免疫細(xì)胞逐漸減少，導(dǎo)致抗體免疫力逐漸下降，對結(jié)核抗原的應(yīng)答能力也趨于下降[11]。而肺結(jié)核的小鼠模型也發(fā)現(xiàn)，年長小鼠和年輕小鼠的輔助T1淋巴細(xì)胞(Th1)數(shù)量有差別，且老年小鼠抗原特異性CD4+T細(xì)胞免疫功能受損[12]。Liao等[13]曾報(bào)道在合并HIV陽性的結(jié)核患者中，其IGRAs結(jié)果不確定或結(jié)果陰性，可能與T細(xì)胞絲裂原反應(yīng)被抑制有關(guān)。本研究證實(shí)年齡的增長是T-SPOT.TB結(jié)果出現(xiàn)假陰性的獨(dú)立影響因素，與Hang等[9]和Azghay等[14]報(bào)道一致。

本研究中，假陰性組患者的外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于陽性組患者，其原因可能為：T淋巴細(xì)胞在宿主對結(jié)核分枝桿菌感染的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，Th1細(xì)胞分泌IFN-γ參與細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答，且對MTB感染的保護(hù)性免疫更依賴于T淋巴細(xì)胞的反應(yīng)。淋巴細(xì)胞的減少，使宿主對結(jié)核抗原缺乏應(yīng)答。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)：缺乏T淋巴細(xì)胞的獼猴，或感染了猴免疫缺陷病毒(SIV)的獼猴，顯示出對活動(dòng)性結(jié)核或結(jié)核再感染的易感性增加[15～17]。正因?yàn)榱馨图?xì)胞減少，且對結(jié)核抗原的應(yīng)答下降，使結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ不足或不產(chǎn)生，從而使T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

在結(jié)核分枝桿菌侵入人體后，宿主產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)中單核-吞噬細(xì)胞是抗原遞呈細(xì)胞和主要的抗菌效應(yīng)細(xì)胞。單核細(xì)胞是結(jié)核感染免疫的重要起始和效應(yīng)細(xì)胞，在吞噬抗原后將所攜帶的抗原決定簇轉(zhuǎn)交給淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。而單核細(xì)胞減少，必將導(dǎo)致抗原遞呈降低從而使幼稚型CD4T淋巴細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞減少，引起IFN-γ分泌不足或不產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，較低數(shù)目的單核細(xì)胞是產(chǎn)生T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的獨(dú)立影響因素。

在單因素回歸分析中，本研究發(fā)現(xiàn)合并糖尿病不是T-SPOT.TB假陰性結(jié)果的影響因素。但Faurholt-Jepsen等[18]曾報(bào)道，糖尿病與結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ水平下降有關(guān)，空腹血糖越高，結(jié)核分枝桿菌特異性IFN-γ水平越低。而Walsh等[19]也報(bào)道，T-SPOT.TB檢測的敏感度不會(huì)因患者合并糖尿病而降低。本研究的回歸分析發(fā)現(xiàn)空腹血糖升高并不是導(dǎo)致T-SPOT.TB出現(xiàn)假陰性結(jié)果的獨(dú)立影響因素。筆者認(rèn)為，出現(xiàn)不同結(jié)論也許與合并糖尿病的結(jié)核患者是否應(yīng)用降糖藥物，是否血糖得到控制有關(guān)。在本研究中，假陰性組40%(16/40)患者未經(jīng)過降糖藥物治療，其空腹血糖超過10.0mmol/L，其余假陰性組60%合并糖尿病的結(jié)核患者已經(jīng)過降糖藥物治療。Tan等[20]也曾觀察到，在血糖控制良好的糖尿病合并結(jié)核患者，T-SPOT.TB檢測的陰性預(yù)測值明顯高于血糖控制不佳的患者。

在本研究中，兩組病例在結(jié)核病史、是否合并肺外結(jié)核及是否合并糖尿病等合并癥上未有明顯差異，且兩組病例在紅細(xì)胞沉降率、C反應(yīng)蛋白等指標(biāo)中未出現(xiàn)差異，與以往文獻(xiàn)報(bào)道不同[21]。可能與患者處于疾病不同階段有關(guān),紅細(xì)胞沉降率和C反應(yīng)蛋白均是反應(yīng)感染的指標(biāo)，而Azghay等[14]認(rèn)為合并細(xì)菌感染會(huì)使IGRAs結(jié)果呈假陰性。但因條件所限，本研究并未進(jìn)一步觀察PPD硬結(jié)直徑與T-SPOT.TB結(jié)果之間的關(guān)系，也未觀察到重癥、輕癥結(jié)核患者對T-SPOT.TB結(jié)果的影響，還需今后開展更全面的臨床研究加以闡明。

綜上所述，對于疑似結(jié)核的老年患者，或淋巴細(xì)胞降低、單核細(xì)胞降低的疑似結(jié)核患者，即使T-SPOT.TB結(jié)果為陰性，也應(yīng)結(jié)合臨床，判斷是否為細(xì)胞免疫功能低下導(dǎo)致的T-SPOT.TB結(jié)果為假陰性，避免因假陰性結(jié)果延誤診斷及治療。