妊高癥患者胎盤MiR-26b和Nkx2-5的表達(dá)水平及臨床意義

魏 娜 李江麗 宋亞南

妊娠高血壓疾病(pregnancy-induced hypertension，PIH)簡稱妊高癥，為女性妊娠期特有的疾病，病因尚不明確，為全球性產(chǎn)科難題。中國妊高癥的發(fā)生率為9.4%，為導(dǎo)致孕產(chǎn)婦、圍生兒發(fā)病甚至死亡的主要原因之一[1，2]。目前尚缺乏特異、敏感的生物標(biāo)志物對妊高癥進(jìn)行盡快診斷。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，通過調(diào)控靶mRNA降解與翻譯抑制從而使靶基因表達(dá)下調(diào)，且miRNAs表達(dá)具有組織、器官特異性[3]。雖然妊高癥的發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，但研究者認(rèn)識到胎盤可能是引發(fā)妊高癥的主要誘因，因?yàn)殡S著胎盤排出體外，妊高癥癥狀逐漸消失。近年來研究表明，在妊高癥孕婦的胎盤中大量miRNAs表達(dá)異常[4，5]。Nkx2-5是最早發(fā)現(xiàn)的與先天性心臟病相關(guān)的基因，但其在妊高癥中的作用還未被研究[6]。故本研究通過探究MiR-26b、Nkx2-5在妊高癥患者胎盤中的表達(dá)水平及臨床意義，以期為妊高癥的臨床診斷提供一定的參考價值。

資料與方法

1.臨床資料：選擇2016年3月～2017年10月于筆者醫(yī)院婦產(chǎn)科接受治療的60例妊高癥患者為實(shí)驗(yàn)組，其中包括20例妊娠期高血壓患者、20例輕度子癇前期患者和20例重度子癇前期患者，患者年齡21～34歲，平均年齡28.08±4.52歲，平均孕周37.84±3.48周，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸主編的《婦產(chǎn)科學(xué)(第8版)》[7]。另選擇同期住院的20例健康孕婦作為對照組，年齡23～32歲，平均年齡27.96±2.74歲，平均孕周38.78±3.66周。所選病例均為單胎初產(chǎn)婦，無原發(fā)性心臟、肝臟、腎臟疾病史，無其他妊娠并發(fā)癥及合并癥。各組產(chǎn)婦間年齡、孕周等比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.主要試劑：MirVanaTMmiRNA提取試劑盒購自美國Ambion公司；Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taqman Universal PCR Master Mix及MiR-26b、U6引物購自美國Applied Biosystems公司；組織蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；小鼠抗人Nkx2-5單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

3.標(biāo)本收集：所有孕婦在胎盤娩出后，留取胎盤中部的新鮮組織，注意避開鈣化、壞死區(qū)，分成2份，于液氮中凍存待用。

4.qRT-PCR檢測胎盤組織MiR-26b水平：取出液氮凍存的胎盤組織，采用MirVanaTMmiRNA提取試劑盒提取miRNA，操作步驟詳見說明書。用微量紫外分光光度計檢測其純度及濃度后，取2μg RNA，采用Taqman microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用Taqman Universal PCR Master Mix檢測MiR-26b表達(dá)，20μl體系配制如下：Taqman Master Mix 10μl、Taqman miRNA assay Mix 1μl、cDNA 1.5μl、ddH2O 7.5μl?；靹蚝笾糜趯?shí)時熒光定量PCR儀(美國Beckman Couhe公司)上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：50℃ 2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，進(jìn)行40個循環(huán)。選取U6為內(nèi)參，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCT法分析qRT-PCR結(jié)果，ΔCT=(CTMiR-26b- CTU6)±SD；ΔΔCT=(ΔCTMiR-26b-ΔCTU6)±SD。MiR-26b與U6引物序列詳見表1。

表1 MiR-26b與U6引物序列

5.Western blot法檢測胎盤組織Nkx2-5 水平：取出液氮凍存的胎盤組織，充分研磨，用組織蛋白提取試劑常規(guī)提取蛋白。取適量蛋白樣品，BCA法定量后調(diào)節(jié)濃度；將蛋白樣品與2×SDS緩沖液等體積混合，加熱變性；SDS-PAGE電泳分離蛋白；將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜；將膜清洗后浸沒于5%牛血清蛋白溶液中，室溫封閉1h；將膜清洗后浸沒于一抗稀釋液(小鼠抗人Nkx2-5一抗溶液按1∶100比例稀釋)中，4℃孵育過夜；次晨將膜清洗后浸沒于二抗稀釋液(FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG按1∶1000比例稀釋)中，室溫孵育2 h；將膜清洗后浸沒于新配制的顯色液中顯色，待出現(xiàn)清晰的條帶時停止。選取β-actin為內(nèi)參蛋白。采用GIS-2020數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)掃描并分析蛋白雜交條帶。

結(jié) 果

1.各組病例間的一般臨床資料比較：輕度子癇前期組和重度子癇前期組的新生兒體重及胎盤重量較健康對照組均顯著降低(P<0.05)，妊娠期高血壓組的新生兒體重及胎盤重量與健康對照組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表2。

表2 各組病例間的一般臨床資料比較

與健康對照組比較，*P<0.05

2.各組胎盤組織中MiR-26b表達(dá)水平：qRT-PCR結(jié)果顯示，妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組胎盤組織中MiR-26b的表達(dá)水平較健康對照組均顯著升高(P<0.05)，且隨著病情的加重，MiR-26b的表達(dá)水平逐漸上升(P<0.05),結(jié)果見表3。

表3 各組胎盤組織中MiR-26b表達(dá)水平比較

與健康對照組比較，*P<0.05

3.各組胎盤組織中Nkx2-5表達(dá)水平：Western blot法檢測結(jié)果顯示，妊娠期高血壓組、輕度子癇前期組和重度子癇前期組胎盤組織中Nkx2-5的蛋白表達(dá)水平較健康對照組均顯著降低(P<0.05)，且隨著病情的加重，MiR-26b的蛋白表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，結(jié)果見圖1、表4。

圖1 各組胎盤組織中Nkx2-5的Western blot檢測結(jié)果

表4 各組胎盤組織中Nkx2-5蛋白相對表達(dá)灰度值

與健康對照組比較，*P<0.05

4.妊高癥患者胎盤組織MiR-26b、Nkx2-5表達(dá)水平的相關(guān)性：胎盤組織中MiR-26b表達(dá)水平與Nkx2-5蛋白表達(dá)水平顯著呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),結(jié)果見圖2。

圖2 妊高癥患者胎盤組織中MiR-26b、Nkx2-5表達(dá)水平的相關(guān)性

5.妊高癥患者胎盤組織MiR-26b、Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤重量的相關(guān)性：妊高癥患者胎盤組織MiR-26b水平與新生兒體重、胎盤重量顯著呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤重量顯著呈正相關(guān)(P<0.05),結(jié)果見表5。

表5 妊高癥患者胎盤組織MiR-26b、Nkx2-5水平與新生兒體重、胎盤重量的相關(guān)系數(shù)

*P<0.05

討 論

妊高癥是妊娠時出現(xiàn)的常見疾病，以大量血管收縮、子宮胎盤灌注不足為主要特征[8]。WHO數(shù)據(jù)顯示，妊高癥的發(fā)生率為6%～10%[9]。妊娠高血壓疾病的臨床特征很多，包括蛋白尿性高血壓(子癇前期)、非蛋白尿性高血壓、疊加子癇前期的慢性高血壓和不疊加子癇前期的慢性高血壓。蛋白尿性高血壓若治療不及時，將會發(fā)展成極為嚴(yán)重的子癇，最后可造成患者流產(chǎn)，甚至導(dǎo)致產(chǎn)婦、圍生兒死亡，或者遺傳給胎兒，導(dǎo)致胎兒患有先天性高血壓[10～12]。目前妊高癥尚未有特異、高效的治療方法，若能對妊高癥的跡象及早檢出，可避免絕大部分母體、胎兒并發(fā)癥的發(fā)生。

miRNAs是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)長度為21～23nt的小RNA，參與調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、應(yīng)激等各種生命活動，顯示miRNAs可能具有多樣化的生理功能。在不一樣的組織、器官及發(fā)育階段，miRNAs表達(dá)存在大量差異，而且體內(nèi)存在特定的小分子顆粒能保護(hù)miRNAs避免與RNA酶接觸而被分解掉，故而在血漿和組織中的miRNAs可很穩(wěn)定地存在[13～15]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)，miRNAs表達(dá)異?？稍斐善浒谢虮磉_(dá)也異常，從而對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重大影響[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤組織中有一些miRNAs大量表達(dá)，而在孕婦體內(nèi)胎盤組織以“偽腫瘤”的狀態(tài)存在，暗示胎盤miRNAs很有可能參與調(diào)控胎兒的生長發(fā)育，如缺氧時胎盤中MiR-210含量急劇上升，結(jié)果造成胎盤線粒體功能異常[17，18]。胎盤中MiR-20a高表達(dá)可對FOXA1表達(dá)產(chǎn)生抑制，進(jìn)而對細(xì)胞的增殖、侵襲能力造成影響。近期有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期胎盤中MiR-26a顯著升高，其可能通過靶向Smad1調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞系的增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者胎盤組織中MiR-26b的表達(dá)水平較健康對照組均顯著升高，且隨著病情的加重，MiR-26b的表達(dá)水平逐漸上升，且與新生兒體重、胎盤重量呈負(fù)相關(guān)，這些結(jié)果表明妊高癥患者胎盤組織MiR-26b表達(dá)顯著上調(diào)，且與病情有關(guān)，MiR-26b有望成為妊高癥的臨床診斷因子。

妊娠中晚期出現(xiàn)的妊高癥若未得到有效診斷與治療可造成胎兒致死或不良妊娠后果，導(dǎo)致這種結(jié)局的主要原因是胎兒心功能不良[20，21]。Nkx2-5是影響心臟發(fā)育過程最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，Nkx2-5基因發(fā)生突變，可造成其蛋白產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄活性降低，進(jìn)而影響下游基因的表達(dá)，導(dǎo)致心臟發(fā)育畸形，結(jié)果造成先天性心臟病的發(fā)生[22]。心臟發(fā)育成熟后，Nkx2-5表達(dá)區(qū)域有限，僅在心臟房室肌細(xì)胞表達(dá)，但對心臟活動的正常進(jìn)行至關(guān)重要；心臟發(fā)育過程中Nkx2-5表達(dá)異常易引發(fā)先天性心臟病，也可能對成年后心臟的正常功能造成影響，暗示Nkx2-5在妊高癥患者胎盤中的表達(dá)也可能出現(xiàn)了異常。本研究發(fā)現(xiàn)，妊高癥患者胎盤組織中Nkx2-5的蛋白表達(dá)水平較健康對照組均顯著降低，且隨著病情的加重，MiR-26b水平不斷降低，且胎盤組織中MiR-26b水平與Nkx2-5水平呈負(fù)相關(guān)，與新生兒體重、胎盤重量呈正相關(guān)，這些結(jié)果顯示妊高癥患者胎盤中Nkx2-5表達(dá)顯著下調(diào)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，可能對胎兒的正常生長發(fā)育造成了影響，說明Nkx2-5可對妊高癥的臨床診斷提供參考。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)妊高癥患者胎盤中MiR-26b表達(dá)顯著上調(diào)、Nkx2-5表達(dá)顯著下調(diào)，它們的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，且與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，在重度子癇前期中表達(dá)變化最大，說明MiR-26b、Nkx2-5參與了妊高癥的發(fā)生、發(fā)展過程，這對妊高癥的臨床診斷提供有價值的參考。然而，妊高癥發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)因素很多，相關(guān)機(jī)制復(fù)雜，MiR-26b、Nkx2-5能否作為妊高癥的診斷因子，還需擴(kuò)大樣本量、延長追蹤時間進(jìn)一步研究。