高效液相色譜法測定五氯柳胺混懸液的含量及有關物質

白玉彬，張吉麗，朱建民，蘇文杰，董 朕，周緒正，張繼瑜，*

(1.中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050； 2.常州齊暉藥業有限公司，江蘇 常州 213000)

五氯柳胺(oxyclozanide)是水楊苯酰胺類藥物，化學名為2，3，5，-三氯-N-(3，5-二氯-2-羥基苯基)-6-羥基苯甲酰胺，其作用機理主要是抑制寄生蟲體內的氧化磷酸化過程，阻止ATP的產生，從而導致蟲體死亡[1-3]，主要用于治療肝片吸蟲，同時對絳蟲和線蟲也具有良好的治療效果[4-9]。2013版英國藥典[10]和2010版印度藥典[11]均采用吸光度法測定五氯柳胺混懸液的含量，采用TLC法檢查五氯柳胺混懸液有關物質，我國還沒有有關五氯柳胺檢測方法的相關報道。吸光度法和TLC法的靈敏度、分離度和準確度等均較低，為嚴格有效地控制藥品的質量，筆者通過參考相關文獻[12-19]，采用HPLC方法，建立了HPLC法測定五氯柳胺混懸液含量及有關物質的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

五氯柳胺標準品(德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)，3，5，6-三氯水楊酸(英國藥典委員會)，2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽(英國藥典委員會)，磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)，超純水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)，五氯柳胺混懸液(中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所自制)。

1.1.2 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 含量測定

HPLC條件。色譜柱Hypersil BDS C18(150×4.6 mm，5 μm)；流動相0.1%磷酸水-甲醇(體積比38∶62)；流速為2.0 mL·min-1；檢測波長300 nm；進樣量20 μL；柱溫25 ℃。取本品適量(約相當于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密量取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算，即得。

專屬性試驗。五氯柳胺對照品溶液：精密稱定五氯柳胺對照品6.8 mg，置100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解后，再用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。五氯柳胺供試品溶液：取本品適量(約相當于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心，精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。輔料干擾溶液：不加五氯柳胺的空白混懸液樣品，按供試品溶液配制方法進行配制。3，5，6-三氯水楊酸溶液：精密稱取3，5，6-三氯水楊酸對照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氫呋喃溶解后，用流動相稀釋至刻度，搖勻，得501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液。再準確移取1 mL該溶液于50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，即得。2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液：精密稱取2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽對照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流動相溶解并稀釋至刻度(必要時可超聲溶解)，搖勻，得501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液。再準確移取1 mL該溶液于50 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，即得。專屬性溶液：精密稱取6.8 mg五氯柳胺對照品至100 mL容量瓶，用20 mL甲醇溶解后，再分別加入501 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液和501 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液各2 mL，用流動相定容，搖勻，即得。分別將溶劑、輔料干擾溶液、五氯柳胺對照品溶液、五氯柳胺供試品溶液、3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和專屬性溶液照色譜條件進行測定，記錄色譜圖。

標準曲線。精密稱取五氯柳胺適量于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解樣品后，再用流動相定容，搖勻，配制成104.35 μg·mL-1的五氯柳胺標準品母液，再將其依次稀釋為85.01、68.01、52.18、34.01 μg·mL-1的標準品溶液，分別取20 μL進樣，記錄色譜圖。以五氯柳胺標準品的峰面積y為縱坐標，以五氯柳胺標準品的濃度c為橫坐標，繪制峰面積(y)-質量濃度(c)標準曲線。

進樣精密度。照專屬性試驗中對照品溶液配制方法，配制五氯柳胺對照品溶液，照色譜條件連續進樣6針，記錄色譜峰面積，計算峰面積相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。RSD不得大于2.0%。

中間精密度。分別由2個不同的操作人員使用不同的儀器進行測定。取同一批均勻樣品按照供試品溶液配制方法，配制6份供試品溶液，各取20 μL注入高效液相色譜中，照色譜條件測定。記錄色譜峰面積，分別計算RSD。

準確度。精密稱取五氯柳胺標準品適量，置于容量瓶中，加入處方量空白輔料，按照對照品溶液配制方法，分別配制成濃度為34、68、104 μg·mL-1的五氯柳胺對照品溶液，每個濃度各3份，按照色譜條件，精密量取20 μL進樣，記錄峰面積，測定每個樣品的實際濃度，計算各樣品的回收率、平均回收率及RSD。

溶液穩定性。按照供試品溶液配制方法，配制五氯柳胺供試品溶液，分別在0 h和30 h，取20 μL注入液相色譜中，按照色譜條件測定，記錄色譜圖，以五氯柳胺峰面積計算RSD。

耐用性試驗。按照專屬性試驗下對照品溶液及供試品溶液配制方法，分別制備對照品溶液及供試品溶液，分別考察流速變化 ± 0.2 mL·min-1、柱溫變化 ± 5 ℃、流動相比例變化 ± 2%，以及選用同一品牌不同批號和填料或規格類似的不同品牌色譜柱時儀器的色譜行為變化情況，觀察基線分離情況，計算各條件下所測數據的平均值及RSD。

樣品含量的測定。取本品適量(約相當于五氯柳胺68 mg)，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，離心；精密量取上清液5 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，進樣20 μL，記錄峰面積，帶入線性回歸方程，求出檢測的五氯柳胺混懸液樣品的質量濃度。

1.2.2 有關物質測定方法

HPLC條件。色譜柱為InertSustainSwift C18(150×4.0 mm，5 μm)；以0.1%磷酸水溶液-甲醇(體積比38∶62)為流動相，流速為1.5 mL·min-1；檢測波長為300 nm，進樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。

有關物質測定方法。取本品適量(約相當于五氯柳胺102 mg)，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇超聲溶解并充分混勻，用流動相稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清液作為供試品溶液；精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。精密量取對照溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按不加校正因子的主成分自身對照法以峰面積計算，單個雜質不得超過0.5%，雜質總量不得超過1.0%，供試品溶液色譜圖中小于對照溶液主峰面積0.05倍的色譜峰忽略不計。

專屬性試驗。3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液配制方法同1.2.1節專屬性試驗方法。專屬性溶液：精密稱量五氯柳胺對照品51 mg至50 mL容量瓶，用10 mL甲醇溶解后，再加入上述3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸溶液各1 mL，用流動相定容，搖勻，即得。空白輔料溶液：取不含五氯柳胺的空白輔料適量(約2 mL)，精密稱定，于100 mL容量瓶中用20 mL甲醇溶解，充分混勻后，再用流動相稀釋至刻度，搖勻。離心后取上清液進樣。供試品溶液：取本品適量(約相當于五氯柳胺102 mg)，精密稱定，于100 mL容量瓶中，用20 mL甲醇溶解，并充分混勻后，再用流動相稀釋至刻度，搖勻。離心后取上清液進樣。按色譜條件，精密量取20 μL的3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、專屬性溶液、空白輔料溶液、供試品溶液進樣，記錄色譜圖。空白輔料溶液峰、3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰分離度均大于1.5，不干擾主峰測定，表明該方法專屬性好。記錄色譜圖。

標準曲線繪制。3，5，6-三氯水楊酸溶液配制：精密量取3，5，6-三氯水楊酸對照品10.2 mg于20 mL容量瓶中，用2 mL四氫呋喃溶解，并用流動相稀釋至刻度，配制成510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸對照品溶液。2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液配制：精密稱取2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽對照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用流動相溶解并稀釋至刻度(必要時可超聲溶解)，搖勻，配制成約510 μg·mL-1的2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液。五氯柳胺對照品溶液：精密稱取五氯柳胺對照品10.2 mg于20 mL容量瓶，用4 mL甲醇溶解，并用流動相稀釋至刻度，搖勻，配制成510 μg·mL-1的五氯柳胺對照品溶液。分別準確移取510 μg·mL-1的3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽溶液和五氯柳胺對照品溶液各5 mL于25 mL容量瓶中，用流動相定容，搖勻，配制成含102 μg·mL-1濃度的各雜質溶液；將其依次稀釋，配制成約含各雜質濃度為20.40、10.20、5.10、2.04、0.51 μg·mL-1的雜質混合溶液。分別取20 μL進樣，記錄色譜圖，以標準品的峰面積y為縱坐標，以標準品的濃度c為橫坐標，繪制峰面積(y)-質量濃度(c)標準曲線。

進樣精密度。取線性測試項下的0.51 μg·mL-1的雜質混合溶液，照色譜條件連續進6針，記錄色譜峰面積，計算RSD。計算峰面積RSD。

中間精密度。取同一批均勻樣品，按照供試品溶液配制方法配制6份供試品溶液，由一名試驗員按方法規定分別測定上述6個樣品。由另一名試驗員按方法規定，在不同一天選擇不同的儀器，另外分別配制和測定6個樣品。記錄色譜圖，計算RSD。

定量限和檢測限。配制2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸和五氯柳胺的標準溶液，并將其依次稀釋，進樣分析，計算信噪比，當信噪比為3時，該濃度為檢測限，信噪比為10時，該濃度為定量限。

準確度。精密稱定五氯柳胺混懸液適量(約相當于含五氯柳胺51 mg)于50 mL容量瓶中，并加入處方輔料，加入10 mL甲醇溶解，加入適量2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸，配制成含各雜質濃度約為0.35、5.8、20.4 μg·mL-1的雜質混合溶液各3份，精密量取20 μL，進樣，計算回收率。

溶液穩定性：按照對照溶液及供試品溶液配制方法，分別配制對照溶液及供試品溶液，分別測定新配制樣品及在樣品箱中放置48 h后的樣品溶液。

耐用性試驗：照專屬性試驗中專屬性溶液、供試品溶液及對照溶液配制方法，配制專屬性溶液、供試品溶液及對照溶液，分別考察流速改變±0.2 mL·min-1、柱溫改變±5℃、流動相比例改變± 2%以及選用不同批號或不同廠家色譜柱的儀器色譜行為變化，觀察基線分離情況，計算各條件下所得數據的平均值及RSD。

有關物質檢查：照有關物質測定方法項下方法，分別配制供試品溶液和對照溶液，分別取20 μL進樣。供試品溶液記錄的色譜圖中，如有雜質峰(不包括溶劑峰)，單個雜質不得超過0.5%，總雜質含量不得超過1.0%。

2 結果與分析

2.1 含量測定結果

2.1.1 專屬性試驗

輔料干擾峰及雜質3，5，6-三氯水楊酸溶液、2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽產生的峰與主峰完全分離，分離度均大于1.5，證明該方法專屬性好。

2.1.2 標準曲線

以五氯柳胺標準品的峰面積y為縱坐標，以五氯柳胺標準品的濃度c為橫坐標，繪制峰面積(y)-質量濃度(c)標準曲線，求得標準曲線的回歸方程為y=237288.952c+18980.896，決定系數R2=1.000，表明該方法可用于五氯柳胺混懸液含量測定。

2.1.3 進樣精密度

連續進6針五氯柳胺對照品溶液，其峰面積分別為1 6154 972、16 145 538、16 157 408、16 159 043、16 173 572、16 183 977，RSD為0.1%，小于2.0%，表明本方法的進樣精密度良好。

2.1.4 中間精密度

由表1結果可知，第1人測得含量RSD為0.36%，第2人測定含量RSD為0.11%，平均RSD為0.23%，均小于2.0%，表明該方法中間精密度好。

2.1.5 準確度

由表2結果可知，3個濃度下的回收率分別為100.43%、99.97%、99.97%，平均回收率為100.12%，回收率RSD<2%，證明該方法回收率好。

2.1.6 溶液穩定性

供試品溶液在室溫下放置30 h后，其峰面積未發生明顯變化，峰面積RSD=0.1%，小于2.0%，表明本樣品在室溫下放置30 h穩定。

表1中間精密度試驗結果

Table1Results of intermediate precision

人員Personnel重復Repeats含量Content/%平均含量Average content/%RSD/%甲1106.6106.220.36A2106.63105.94105.85106.56105.9乙1107.3107.500.11B2107.53107.54107.65107.56107.6

2.1.7 耐用性試驗

由表3結果可知，主峰與雜質峰均達到基線分離，在流速改變 ± 0.2 mL·min-1、柱溫改變±5℃、流動相比例改變±2%，以及選用不同批號或不同廠家色譜柱條件下所測主成分標示含量的RSD均小于2.0%，說明流動相比例、柱溫及流速等條件的微小變化對含量測定結果無顯著影響，表明該方法耐用性好。

2.1.8 樣品含量

參照含量測定方法，測定3批中試樣品的含量，3批中試樣品含量分別為100.9%、101.1%、101.0%，均在標示量范圍(95%～105%)內。

2.2 五氯柳胺混懸液有關物質測定結果

2.2.1 專屬性試驗

空白輔料溶液峰、雜質3，5，6-三氯水楊酸溶液和2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰與主峰分離度均大于1.5，不干擾主峰測定，表明該方法專屬性好。

2.2.2 標準曲線

表2回收率實驗結果

Table2Results of recovery

理論濃度Theoretical concentration/(μg·mL-1)重復Repeats實際濃度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%平均回收率Average recovery/%RSD/%34134.18190100.5100.430.06234.12455100.4334.13033100.468168.00144100.099.970.06267.9616999.9368.01171100.01041104.2706299.999.970.062104.32736100.03104.36308100.0

表3含量測定耐用性實驗結果

Table3Durability results of content determination

變化項Change items主峰及各雜質峰基線分離Separation of the main peakfrom the adjacent peak含量Content/%平均含量Averagecontent/%RSD/%柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃是Yes104.8105.20.83柱溫不變 Column temperature unchanged是Yes106.2柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃是Yes104.6流動相比例-2% Proportion of mobile phase-2%是Yes105.1105.50.58流動相比例不變 proportion of mobile phase unchanged是Yes106.2流動相比例+2% Proportion of mobile phase+2%是Yes105.2流速-10% Flow rate-10%是Yes104.6105.30.78流速不變 Flow rate unchanged是Yes106.2流速+10% Flow rate+10%是Yes105.1色譜柱1 Column 1是Yes100.5100.70.17色譜柱不變 Column unchanged是Yes100.5色譜柱2 Column 2是Yes100.8色譜柱3 Column 3是Yes100.8

2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽標準曲線線性回歸方程為y=130721.123c+36630.203，其相關系數為0.996；3，5，6-三氯水楊酸標準曲線線性回歸方程為y=123451.705c+2478.855，其相關系數為1.000；五氯柳胺標準曲線線性回歸方程為y=318112.192c-11199.561，其相關系數為1.000，線性關系良好。表明以上標準曲線可用于五氯柳胺混懸液有關物質的測定。

2.2.3 進樣精密度

由表4可知，連續進6針雜質混合溶液，已知雜質2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽峰面積RSD為3.73%，3，5，6-三氯水楊酸峰面積RSD為0.24%，五氯柳胺峰面積RSD為0.17%，均小于2.0%，表明本方法的進樣精密度良好。

2.2.4 中間精密度

由表5可知，已知雜質2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸在供試品溶液中未檢出，2個人員測得的總雜質RSD均為0，平均RSD為0，表明該方法中間精密度好。

2.2.5 定量限和檢測限

表4進樣精密度

Table4Results of injection precision

樣品名Sample names濃度Content/(μg·mL-1)重復Repeats峰面積Peak area平均峰面積Average areaRSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽5.078017171886925653.732-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride269337036942414718508568403366480523,5,6-三氯水楊酸4.984016176776172140.243,5,6-trichlorosalicylic acid26166583615636461975856159646617588五氯柳胺5.04791159025015854630.17Oxyclozanide2158584331583286415861455158322661584028

表5中間精密度

Table5Results of intermediate precision

人員Personel重復Repeats雜質含量Impurity content/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽2-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride3,5,6-三氯水楊酸3,5,6-trichlorosalicylic acid總雜質Total impurityRSD/%甲1<0.05<0.050.320A2<0.05<0.050.323<0.05<0.050.324<0.05<0.050.325<0.05<0.050.326<0.05<0.050.32乙1<0.05<0.050.300B2<0.05<0.050.303<0.05<0.050.304<0.05<0.050.305<0.05<0.050.306<0.05<0.050.30

試驗結果表明：2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽定量限為0.064 8 μg·mL-1，檢測限為0.019 6 μg·mL-1；3，5，6-三氯水楊酸定量限為0.097 9 μg·mL-1，檢測限為0.029 7 μg·mL-1；五氯柳胺溶液定量限為0.141 8 μg·mL-1，檢測限為0.043 9 μg·mL-1。

2.2.6 準確度

由表6可知，2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽平均回收率為110.3%，RSD均小于1%；3，5，6-三氯水楊酸平均回收率為98.6%，RSD均小于2%。證明該方法準確度好。

2.2.7 溶液穩定性

穩定性試驗結果表明，已知雜質2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸未檢出，未知雜質1及未知雜質2放置48 h后含量未發生變化，雜質1含量均為0.15%；雜質2含量均為0.17%，總雜質含量為0.3%。表明樣品在室溫下放置48 h穩定。

2.2.8 耐用性

從專屬性溶液和樣品溶液耐用性測定結果(表7、表8)可以看出，隨著流動相、流速、柱溫以及色譜柱的變化，色譜峰分離度均>1.5，理論塔

表62-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽和3，5，6-三氯水楊酸回收率

Table6Recovery of 2-amino-4， 6-dichlorophenol hydrochloride and 3，5，6-trichlorosalicylic acid

雜質名稱Impurity names理論濃度Theoreticalconcentration/(μg·mL-1)實際濃度Actual concentration/(μg·mL-1)回收率Recovery/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽0.35100.35218100.30.72-amino-4,6-dichlorophenol hydrochloride0.35399100.80.35706101.75.09855.77210113.20.65.83414114.45.78723113.520.394023.82707116.80.323.73363116.423.69940116.23,5,6-三氯水楊酸0.51070.4750993.01.13,5,6-trichlorosalicylic acid0.4837294.70.4749293.05.10705.15447100.90.55.19728101.85.14725100.820.428020.69724101.30.320.60344100.920.58160100.8

表7專屬性溶液耐用性測定結果

Table7Durability of specific solution

樣品名Sample name變化項Change items保留時間Remain time/min理論塔板數Theoretical plate number分離度Resolution2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽正常條件Normal condition1.9834205—2-amino-4,6-dichlorophenol流動相比例+2% Proportion of mobile phase+2%2.0674446—hydrochloride流動相比例-2% Proportion of mobile phase-2%1.8174148—流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-12.2474782—流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-11.7073894—柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃1.8674267—柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃2.0004214—色譜柱1 Column 11.8032433—色譜柱2 Column 21.82728196.7色譜柱3 Column 33.1003438—色譜柱4 Column 41.8133450—

續表7

“—”表示未測得數據。

“ —” represent no data was measured.

表8樣品溶液耐用性試驗結果

Table8Durability test of Sample solution

樣品名Sample names變化項Change items雜質含量/%Content ofimpurity/%雜質平均含量Averagecontent/%RSD/%2-氨基-4,6-二氯苯酚鹽酸鹽正常條件 Normal condition<0.052-amino-4,6-dichlorophenol柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/Ahydrochloride柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流動相比例-2% Proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流動相比例+2% Proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色譜柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色譜柱2 Column 2<0.05色譜柱3 Column 3<0.053,5,6-三氯水楊酸正常條件 Normal condition<0.053,5,6-trichlorosalicylic acid柱溫-5 ℃ Column temperature-5 ℃<0.05<0.05N/A柱溫+5 ℃ Column temperature+5 ℃<0.05流動相比例-2% The proportion of mobile phase-0.2%<0.05<0.05N/A流動相比例+2% The proportion of mobile phase+0.2%<0.05流速-2 mL·min-1 Flow rate-2 mL·min-1<0.05<0.05N/A流速+2 mL·min-1 Flow rate+2 mL·min-1<0.05色譜柱1 Column 1<0.05<0.05N/A色譜柱2 Column 2<0.05色譜柱3 Column 3<0.05

續表8

N/A代表不適用。

N/A represent not applicable.

板數均>2 400，已知雜質能夠完全分離。流速改變±0.2 mL·min-1、柱溫改變±5 ℃、流動相比例改變±2%及選用不同批號或不同廠家色譜柱，已知雜質2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸在樣品中未能檢測出，總雜質含量均小于1%，RSD均小于10%。試驗結果表明，流動相比例、柱溫、流速以及色譜柱等條件改變對有關物質的測定結果無明顯影響，說明該方法耐用性良好。

2.2.9 有關物質

照有關物質測定方法，測定3批中試樣品的有關物質，結果表明，3批中試樣品中2個未知雜質含量均小于0.5%，總雜質含量均小于1%(表9)。

表9有關物質測定結果

Table9he results of impurity determination %

3 討論

2013版英國藥典中采用紫外分光光度法測定五氯柳胺混懸液的含量，采用TLC法測定五氯柳胺混懸液有關物質含量，以點濃度深淺來判斷已知雜質2-氨基-4，6-二氯苯酚鹽酸鹽、3，5，6-三氯水楊酸的濃度是否超過限度。上述2種方法靈敏度、準確度和分離度均較差，且TLC方法不能準確定量檢測，影響實驗結果的測定。HPLC方法靈敏度高、準確度好，能夠準確定量檢測，參考相關文獻，本研究建立了用于測定五氯柳胺混懸液含量及有關物質的HPLC方法。

為了確定五氯柳胺混懸液的最大吸收波長，按照對照品溶液及供試品溶液方法，配制對照品溶液及供試品溶液，采用DAD檢測器進行全波長掃描，確定五氯柳胺的最大吸收波長為300 nm，這一結果與英國藥典結果一致，所以選擇300 nm作為檢測波長。對于流動相的考察，首先分別選用乙腈-水及甲醇-水作為流動相，發現五氯柳胺峰形較差，為了解決這一問題，向水相中加入0.1%的磷酸，以調整峰形。發現以0.1%磷酸-甲醇溶液作為流動相時峰形優于0.1%磷酸-乙腈溶液。

動物寄生蟲病是動物常發且造成巨大損失的傳染病，肝片吸蟲作為一種常見人畜共患病原體，長期危害人類及動物的健康，藥物防治是肝片吸蟲病防控的關鍵。五氯柳胺作為化學合成類抗肝片吸蟲藥物，具有性質穩定、療效顯著等優點，是新型、高效、安全的抗肝片吸蟲藥物，且該藥具備無污染、低殘留等良好的理化性質，與其他具有相似作用的三氯苯達唑、氯苯碘柳胺、阿苯達唑等藥物相比，五氯柳胺至今未出現耐藥性的相關報道[20-21]，并憑借其顯著的治療效果在國外得到廣泛使用，是臨床抗蠕蟲感染的首選。至今為止，國內對五氯柳胺的研究停留在原料藥方面，尚未有五氯柳胺相關制劑的報道[22-24]。針對目前嚴重危害我國動物養殖業和公共衛生安全的動物寄生蟲疾病，開發國內新型動物專用抗寄生蟲病藥物五氯柳胺及其制劑，對解決目前我國所使用的抗寄生蟲藥物存在的耐藥性、副反應大和治療效果不確實等問題具有重大的意義。建立完善的五氯柳胺混懸液含量及有關物質檢測方法，為控制產品質量提供有效的分析手段及理論依據，對產品的安全使用具有重要意義。