cetuximab聯合5-FU對直腸癌放射治療敏感度影響的實驗研究

左志貴 王蓉蓉 葉星照 史壹雄 姜有恒 宋華羽 倪士昌 蔣 磊

行新輔助放療后再接受手術是目前局部進展期直腸癌的標準治療策略，但是臨床實踐中直腸癌單純放射治療(以下簡稱放療)效果并不理想，對放療有明顯效果、部分效果和效果不明顯的患者各占約1/ 3左右[1]。對于沒有明顯效果的患者采用術前放療則可能導致疾病在治療過程中進展，從而延誤患者手術治療，將化療與放療聯合提高了直腸癌術前單純放療的效果，目前局部進展期直腸癌新輔助治療推薦放療與希羅達聯合進行，但效果仍然不很理想，如何進一步提高局部進展期直腸新輔助治療的效果一直是結直腸癌領域基礎及臨床研究的熱點[2，3]。筆者前期研究及國內外其他研究顯示EGFR通路在放療抵抗中發揮重要作用[4]。那么通過阻斷EGFR通路可以預期在既往基礎上進一步提高術前放化療效果，目前臨床廣泛使用的EGFR通路阻斷劑是西妥昔單抗，本研究旨在通過細胞及動物實驗明確EGFR通路阻斷劑西妥昔單抗是否可以在同步化療基礎上進一步提高放療對結直腸癌細胞的治療效果。

材料與方法

1.實驗材料：結直腸癌細胞系RKO為溫州醫科大學附屬第一醫院中心實驗室傳代獲取，前期已經篩選用于實驗的RKO細胞滿足3個條件:①EGFR中高表達;②K-ras基因為野生型;③PIK3CA基因為突變型。本實驗所需4～6周齡BALB/CA裸鼠(SPF級，雌性)均購自上海實驗動物資源中心,實驗動物許可證號SYXK(瀘)2013-0056；DMEM完全培養液、胎牛血清購自美國Thermo生物公司；CKK-8試劑盒，購自碧云天公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自美國eBioscience公司，細胞DNA含量檢測試劑盒PI/RNase Staining Buffer(細胞周期檢測)購自BD Pharmingen公司。

2.細胞培養及處理：采用DMEM完全培養液(含15%胎牛血清)，加入100U/ml鏈霉素和100U/ml青霉素培養RKO細胞，每48h傳代1次，培養條件：5%CO2、37℃。無菌操作，收集對數生長期細胞用于實驗。

3.CKK-8法檢測氟尿嘧啶給藥劑量(IC50)：在DMEM培養基中分別加入氟尿嘧啶干預的濃度梯度為0、5、10、25、50、100μg/ml，藥物干預48h后對各個濃度梯度行CCK8檢測計算各個濃度梯度細胞生長抑制率。將各個濃度與濃度相應的細胞生長抑制率一起通過SPSS軟件繪制氟尿嘧啶濃度生長抑制曲線，取氟尿嘧啶對細胞生長抑制率為30%～40%作為該實驗氟尿嘧啶干預的實驗濃度。最終本研究選取的氟尿嘧啶工作濃度為2.5μg/ml，西妥昔單抗采用文獻普遍采用的濃度100μg/ml。

4.動物實驗成瘤裸鼠氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥劑量的計算：據氟尿嘧啶及西妥昔單抗在人體結直腸癌治療中的給藥劑量，同時根據實驗動物學給定的不同種屬動物和人有效劑量變異計算每只裸鼠的給藥劑量。4～6周齡裸鼠體重平均20mg，體表面積平均0.008m2。最終氟尿嘧啶給藥劑量換算為每周氟尿嘧啶給藥總量0.36ml，分兩次給予，每次給予0.18ml，西妥昔單抗每周給藥總量0.4ml，分兩次給予，每次0.2ml。

5.CKK-8法檢測不同干預方式對腫瘤細胞生長的抑制率：RKO細胞系藥物分4個時段分別給予2Gy放療，2Gy放療聯合氟尿嘧啶給藥，2Gy放療聯合西妥昔單抗給藥，2Gy放療聯合氟尿嘧啶及西妥昔單抗給藥，同時設不干預對照組。分別在培養24、48、72、96h進行 CCK-8檢測，生長抑制率(%)=(對照組A平均值-實驗組A平均值)/對照組A平均值×100%。

6.細胞凋亡檢測不同干預對腫瘤細胞凋亡的影響：取6孔板2Gy照射后12h分別給予2.5μg/ml濃度氟尿嘧啶處理、西妥昔單抗100μg/ml濃度處理、氟尿嘧啶聯合西妥昔單抗處理，各處理后細胞系移入37℃孵箱中繼續孵育48h，隨后離心收集各組細胞以標準程序用流式細胞儀檢測凋亡情況。

7.細胞周期檢測不同干預對腫瘤細胞周期的影響：采用以上相同處理方法處理后細胞系移入37℃孵箱中繼續孵育48h，離心收集各組細胞以標準程序用流式細胞儀檢測(MACSQuantTMAnalyzer, Miltenyi Biotec)，一般計數2萬～3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件MACSQuantifyTMversion 2.1分析。

8.裸鼠成瘤模型建立及不同干預的腫瘤抑制情況：取6周雌性裸鼠36只，體重、體積實驗前大致相同，每只裸鼠右前肢腋部皮下分別緩慢注射1×107/ml RKO細胞，當裸鼠皮下開始緩慢出現腫瘤結節，以皮下結節直徑達到0.5cm為成瘤標準，當皮下腫瘤體積增大到60～80cm3時將成瘤成功的30只裸鼠隨機分成5組，每組6只。裸鼠給藥方式為瘤體內多點注射藥物，給藥后每周觀察各實驗組腫瘤生長情況，用直尺測量和計算腫瘤體積，具體測量數據為腫瘤最大直徑(a)和最小直徑(b)，按下列公式計算體積：V(mm3)=(a×b2)/2，按照計算數據描繪各組裸鼠的腫瘤生長曲線。注射干預6周后用脫頸椎發處死裸鼠，剝下腫瘤，稱重。腫瘤的抑瘤率(%)=(對照組平均體積-給藥組平均體積)/對照組平均體積×100%。

結 果

1.不同干預處理對腫瘤細胞生長抑制率的比較：CCK8檢測繪制不同干預方式處理后腫瘤細胞生長曲線(圖1)。氟尿嘧啶和西妥昔單抗均能提高放療線對腫瘤生長的抑制作用，但氟尿嘧啶的作用更明顯，氟尿嘧啶與西妥昔單抗同時與放療聯合對腫瘤細胞生長的抑制作用與氟尿嘧啶單獨與放療聯合對腫瘤細胞生長的抑制作用相當。

圖1 不同干預方式腫瘤細胞生長曲線比較

對不同干預方式處理48h后腫瘤細胞的生長抑制率數據進行統計分析顯示氟尿嘧啶組及西妥昔單抗各自單獨聯合放療均明顯提高了放療對腫瘤細胞的生長抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)，但氟尿嘧啶聯合西妥昔單抗與各自單用相比對提高放療的效果不明顯，抑制率比較，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 不同干預方式處理48h后腫瘤細胞生長抑制率比較

3組之間行方差分析，F=25.12，P=0.001；兩組之間SNK檢驗，P=0.15、0.19、0.23；P值均為與放射總量2Gy放療組比較

2.不同干預處理對腫瘤細胞凋亡發生率的比較：對給予不同干預方式處理48h后的RKO細胞系進行凋亡檢測。流式細胞儀凋亡檢測結果顯示西妥昔單抗及氟尿嘧啶各自與2Gy放療聯合均明顯提高了2Gy單獨放療的凋亡率，氟尿嘧啶與2Gy聯合提高2Gy單獨放療凋亡率更加明顯，西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合對提高2Gy單獨放療的凋亡率并不比氟尿嘧啶聯合對提高2Gy單獨放療的凋亡率更明顯(圖2，表2)。

圖2 不同干預方式處理48h后腫瘤細胞凋亡發生率的比較

表2 不同干預方式處理48h后腫瘤細胞總凋亡率比較

3.不同干預處理對腫瘤周期影響的比較：給予不同干預方式處理48h后RKO細胞系進行細胞周期分布檢測，研究不同干預方式對放療引起G1/G0停頓的影響(圖3)。

圖3 不同干預方式處理48h后腫瘤細胞周期分布的比較

西妥昔單抗與2Gy放療聯合明顯降低了G1/G0期腫瘤細胞比例(P<0.05)，而氟尿嘧啶與2Gy放療聯合則導致細胞周期檢測出現一個明顯凋亡峰，顯示西妥昔單抗提高放療敏感度主要通過改變細胞周期，減少引起對放療損傷逃逸的G1/G0期細胞的比例，氟尿嘧啶提高放療敏感度主要通過增加細胞凋亡發生作用(表3)。

表3 西妥昔單抗聯合放療對細胞周期分布的影響

4.不同干預處理對裸鼠移植瘤重量影響的比較:各組裸鼠成瘤給予不同干預6周后采用脫頸法處死裸鼠，解剖游離瘤體后電子秤給予稱重，解剖過程中注意不要將瘤體中摻雜正常組織。各組移植瘤解剖稱重后計算各組移植瘤重量平均值，同時通過與對照組平均值比較計算不同干預措施對裸鼠移植瘤生長的影響及各組抑瘤率(表4)。

表4 不同干預組瘤體重量比較

結果顯示2Gy+氟尿嘧啶組，2Gy+西妥昔單抗組，2Gy+氟尿嘧啶組+西妥昔單抗組各組瘤體重量均明顯低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而2Gy照射組雖瘤體重量低于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05)。

表5 氟尿嘧啶聯合放療組與單純放療組瘤體重量比較

研究顯示氟尿嘧啶明顯增加了2Gy放療對裸鼠移植瘤生長抑制作用(P<0.05，表5)。西妥昔單抗則沒有明顯增加了2Gy放療對裸鼠移植瘤生長抑制作用(P>0.05，表6)。

表6 西妥昔單抗聯合放療組與單純放療組瘤體重量比較

進一步研究發現,兩藥聯合放療組與氟尿嘧啶單藥聯合放療組瘤體重量比較，差異無統計學意義(P>0.05，表7)，說明西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合并沒有明顯提高氟尿嘧啶單藥與放療聯合的作用。總體說明西妥昔單抗無論是單藥還是聯合對放療敏感度的增加均不明顯。

表7 兩藥同時聯合放組與氟尿嘧啶聯合放療組瘤體重量比較

討 論

放射生物學研究顯示EGFR通路在放射治療過程中腫瘤內分子生物學動態變化中發揮重要作用，參與了放療抵抗，因此當EGFR拮抗劑西妥昔單抗應用于臨床時西妥昔單抗開始與放療聯合治療頭頸部鱗癌，顯示出一定的治療效果[5]。Nasu等[6]研究顯示，C225與放療聯合可以增加肺癌移植瘤A431的放療效果，Liu等[7]研究也顯示C225與放療聯合可以增加前列腺癌細胞的放療敏感度，而Shin等[8]進行的體外研究則顯示西妥昔單抗與放療聯合可以增加結直腸癌細胞系的放療敏感度，因此西妥昔單抗與放療聯合顯示了較好的應用前景。

由于氟尿嘧啶與放療聯合在直腸癌術前放療中的價值已經得到肯定并在臨床中廣泛應用，那么將西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合，如果能進一步提高直腸癌術前放射治療的效果將具有重要的臨床應用價值，而目前尚無西妥昔單抗聯合氟尿嘧啶增加放療效果的基礎研究報道，筆者希望通過基礎研究明確西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合在直腸癌新輔助治療中的價值。

本研究從細胞和動物水平研究氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯合對結直腸癌放療敏感度的影響，結果顯示氟尿嘧啶、西妥昔單抗各自單藥以及兩藥聯合均可以明顯增加2Gy照射對結直腸癌細胞系增殖以及裸鼠移植瘤的生長抑制作用，差異有統計學意義(P<0.05)，氟尿嘧啶聯合2Gy照射的抑制作用較西妥昔單抗聯合的抑制作用更強，而且氟尿嘧啶聯合西妥昔單抗后與單用氟尿嘧啶相比并未明顯增加2Gy照射對裸鼠移植瘤的抑制作用(P>0.05)。

本研究顯示氟尿嘧啶組與西妥昔單抗聯合使用并沒有發揮疊加或協同作用，西妥昔單抗與氟尿嘧啶聯合并沒有提高放療的效果。但本研究是細胞及動物實驗，存在明顯的局限性，目前也有一些臨床研究探討了西妥昔單抗用于放療增敏的問題，Weiss等[9]研究顯示，將西妥昔單抗與卡培他濱及奧沙利鉑聯合并沒有進一步提高卡培他濱與奧沙利鉑聯合放療的效果，考慮到西妥昔單抗臨床治療效果與K-ras突變有關，因此Grimminge等[10]研究局部進展期患者中基因表達與西妥昔單抗聯合化療提高局部進展期術前放療效果的關系，結果顯示治療前EGFR、VEGFR在mRNA水平的表達以及K-ras突變是西妥昔單抗用于術前放療增敏效果的有效分子標志物。

綜上所述，總體上西妥昔單抗與化療藥聯合并沒有提高放療的效果，西妥昔單抗的臨床應用無法改變目前氟尿嘧啶與術前放療聯合在中低位直腸癌新輔助治療中的主導地位，但考慮到腫瘤的異質性，未來尋找對西妥昔單抗用于術前放療增敏效果的有效分子標志物將是重要的研究方向。