3D打印肺混合細胞結構體植入兔體內研究

李躍中 楊亞冬 楊 耿 羅 濤 徐怡朦 唐 靚 張文元

肺是一個由40多個不同的細胞類型組成的復雜器官，它有很大的表面積界面，廣泛地與環境與循環系統接觸。隨著年齡的增長，肺功能損失正越來越成為嚴重的醫療保健問題[1]。肺臟疾病是目前發生率和病死率較高的疾病之一，肺組織在成人慢性破壞后再生能力有限，許多肺部疾患缺乏足夠有效的治療方式[2～4]。肺移植手術在終末期肺疾病的治療中已被廣泛接受，但存在供體嚴重缺乏，而且還存在慢性免疫排斥、術后感染并發癥和潛在的疾病傳播等不良反應[5]。組織工程肺的構建和應用有望解決以上難題，肺基質的再接種是肺再生的一種可行的策略[6]。但是，由于肺組織結構和生理功能的復雜性，目前肺組織工程研究尚無重大進展[7]。構建一個有功能、可移植的組織工程肺面臨嚴峻的挑戰。3D生物打印技術有望突破傳統組織工程技術的局限與障礙，構建工程化組織與器官。本實驗將新生兔肺混合細胞-海藻酸鈉-明膠共混物3D生物打印的水凝膠結構體片段植入兔背部皮下，并通過HE染色與Masson染色觀察植入后水凝膠結構體中的肺混合細胞的存活情況，以便為肺臟的再生研究提供新思路。

材料與方法

1.主要器材和試劑：海藻酸鈉、明膠(美國Sigma-Aldrich公司)，無水CaC12(分析純，上海凌峰化學試劑有限公司)，鈣黃綠素-AM(calcein-AM，CAM)、碘化丙啶(propidium iodide，PI)均為Solarbio產品，低糖-DMEM培養基(美國Gibco公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，6孔塑料培養板(美國Costar公司)。3D生物打印機(Bioscaffolder 2.1，GESIM公司，德國)，CO2培養箱(美國Thermo公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司，IX73)。新西蘭白兔，浙江省實驗動物中心提供。實驗動物質量合格證號：SCXK(浙)2013-0055號。

2.新生兔原代肺混合細胞的提取：新生新西蘭白兔，1日齡，體質量約160g，雌雄不限。斷頭處死后，浸入75%乙醇5min消毒。無菌操作下取出肺臟，修剪周邊，除去雜質。反復沖洗后，用眼科剪將肺組織剪碎約為1mm3的細小碎塊。加入5倍于組織碎塊體積量的0.25%胰蛋白酶，吸管吹打混勻后37℃孵育8min，吸出已消化的細胞懸液，加到含10%胎牛血清的低糖-DMEM培養基中，中止消化。將上述消化過的肺組織小碎塊同法再消化1次，再次吸出已消化的細胞懸液，并再中止消化。合并細胞懸液，充分混合均勻，200目不銹鋼篩過濾，1000r/min離心5min，D-PBS清洗細胞1次，再次1000r/min離心5min。通過臺盼藍染色、計數，確認細胞存活率90%后，用于如下實驗。

3.三維(3D)生物打印肺結構體：參照文獻[8]進行。(1)制備肺細胞共混物:1.6g海藻酸鈉干粉、0.6g明膠干粉加于20ml生理鹽水中，低速攪拌混勻，形成水溶膠。每天70℃×30min水浴，連續3天間歇滅菌。然后將滅菌后的水溶膠與兔原代肺混合細胞懸液混合，輕柔混勻，經300×g離心3min，使氣泡消失。得到細胞密度為1×107cells/ml的肺混合細胞-水溶膠共混物。(2)CAD建模：構建尺寸為8mm×8mm×1.2mm的網格狀結構，微絲逐層交錯堆積形成的孔隙大小設定為600μm×600μm。成形溫度設定為10℃，打印噴頭內徑為0.26mm，打印速率為17mm/s，空氣擠出壓力370kPa，層高0.20mm，料桶溫度32℃，共打印8層。(3)制備肺細胞結構體:將肺細胞共混物置于料桶中，由空氣氣壓推動柱塞水溶膠擠出成形。擠出的微絲逐層交錯堆積于6孔培養板上。打印后立即用5%CaCl2溶液交聯5min，生理鹽水漂洗3次。獲得半透明網格狀帶氣孔的、有較高孔隙率的肺混合細胞-海藻酸鈉-明膠三維結構體，詳見圖1。

圖1 3D生物打印的肺混合細胞-海藻酸鈉-明膠三維結構體

4.新生兔肺細胞結構體的觀察：對打印的肺細胞結構體用活/死細胞雙熒光染色劑(含5μmol/L的鈣黃綠素-AM，其激發波長為488nm；以及含3μmol/L的碘化丙啶，其激發波長為543nm) 37℃染色30min。用熒光倒置顯微鏡分別在488nm和543nm的激發光下對結構體進行觀察，保存圖像，并合并這兩個激發波長的圖像。分別任選5個圖像，計數圖像中的紅、綠熒光點(紅、綠光點分別代表死細胞、活細胞)個數，計算細胞存活率。細胞存活率為活細胞占全部活死細胞的百分數。

5.肺細胞結構體植入兔背部：選取健康新西蘭白兔10只，3月齡，體重約2kg，雌雄不限，隨機分為2組，每組5只。3%戊巴比妥鈉1ml/kg(即30mg/kg)耳緣靜脈注射麻醉，于背部沿正中進行脫毛、消毒、鋪巾，無菌條件下，垂直作1個長約1.7cm的切口，切開背部皮膚。實驗組：每只兔皮下左右兩側各植入1片肺細胞結構體，間距3cm。對照組：同法植入不含肺細胞的結構體。術后全部動物于腹部青霉素連續注射3天，每只動物500000U/d。單籠飼養，任其自由活動，并觀察生存、飲食、活動情況。

6.植入物的組織病理學檢查：植入2周后，將10只動物全部耳緣靜脈空氣針處死。大體觀察后，行組織切片染色觀察。取適量植入物固定，石蠟包埋、切片，HE染色和Masson染色，光鏡觀察。

結 果

1.原代肺混合細胞形態學觀察：倒置顯微鏡下觀察，可見分離的新生兔原代肺混合細胞分布均勻，光澤度良好，細胞以類圓球形為主，還有不規則的多角形、三角形等，細胞飽滿清晰，細胞活力良好，詳見圖2。

圖2 新生兔原代肺混合細胞(×200)

2.三維結構體的肺混合細胞存活率：肺混合細胞三維結構體打印后，通過活/死細胞雙熒光染色，熒光倒置顯微鏡觀察可見，絕大多數細胞呈綠色熒光染色的活細胞，極少量細胞為染成紅色的死細胞，詳見圖3。對活、死細胞進行計數，細胞存活率為83%±2%。

圖3 打印后肺混合細胞三維結構體的雙熒光染色(×100)

3.植入物支架的組織學觀察：體內植入2周后，可見每個植入物大部分尚未降解。HE、Masson染色結果表明，實驗組植入物中肺細胞均勻分布，未見細胞變性及死亡(圖4中A、C)。對照組很少見有細胞(圖4中B、D)。

圖4 植入支架的組織學染色(×400)

討 論

海藻酸鈉、明膠是常用的生物打印材料[9,10]。明膠具有溫度敏感性，溫度較低時可由溶膠轉變為凝膠，使支架得以成形。打印后水凝膠經CaCl2交聯，使支架結構得以穩固。

傳統組織工程技術是將細胞接種于支架表面，細胞難以向內部生長，尤其是支架中心部位細胞生長極少，難以構建結構復雜及具功能活性的工程化組織[11]。而3D生物打印技術能定位裝配生物材料及細胞單元，能夠控制細胞的落點與分布。它改變了傳統組織工程難以將細胞深入到支架內部的弊端，為細胞生長和新陳代謝提供了一個較為合適的環境[12]。3D生物打印的肺臟結構體除了用于移植之外，還可用于體外模擬肺臟進行藥物毒性及安全性評估高通量篩選、藥物有效性測試與新藥發現測試，以及未來藥物治療設計，甚至器官替代[13～15]。構建復雜結構的3D環境，以及細胞異質性問題可以通過3D生物打印技術實現與解決[16]。生物打印的可移植支架最終將被用作治療手段，打印適合于移植的類肺組織可能是克服供體短缺和手術并發癥等問題的一個現實選擇，將于基礎醫學和臨床之間搭建橋梁，可為肺再生領域提供一個新的醫學范例。

然而，在組織工程中應用的3D生物打印技術仍處于初級階段，需要進一步的改進。作為一種移植物，打印組織的功能比形狀更重要，阻礙大規模肺組織再生的一個主要障礙是缺乏伴生的微血管[17]。組織器官需要進行營養物質與氧氣的傳輸，以及代謝廢物的排出。這些都需要有血管或類血管進行血液循環才能完成。不然，處于核心區域的細胞會很快死亡。但是血管細又長，結構復雜，很難打印構建。因此，在血管化、可重復性方面，還需要開展更多的研究[18]。

基于文獻報道，原代分離獲得的肺混合細胞群中含有上皮細胞、成纖維細胞、Ⅰ型及Ⅱ型肺泡細胞，證明了肺混合細胞群由多種細胞構成[1,11,19]。為此本實驗采用從新生兔肺臟中分離肺混合細胞作為種子細胞。本實驗將原代肺混合細胞-海藻酸鈉-明膠共混物逐層交叉堆積而成網格狀圖案的水凝膠3D支架片段，支架里具有逐層交叉的氣孔與較高的孔隙率，適于營養物攝入與代謝廢物排泄等物質交換。結果表明網格模式的生物打印過程并沒有顯著影響肺細胞的活力。原代肺混合細胞-海藻酸鈉-明膠共混網格狀圖案的水凝膠3D支架片段在兔背部皮下可形成帶有肺細胞組織結構的潛力。由于肺組織結構和生理功能的復雜性，構建具有功能和可供移植的人工肺臟仍是一個極為嚴峻的挑戰。