急性腦梗死患者血清miR-21和HIF-1α、VEGF-A的表達關系及臨床意義

向 偉 魏新宇 余 彪

腦梗死(cerebral infarction)，又稱缺血性腦卒中，是一常見的腦血管疾病[1]。我國腦梗死的發生率、致殘率、病死率極高，且腦卒中發病年齡呈年輕化趨勢[2]。由于腦血管疾病病理機制復雜、病情變化迅速，迄今仍缺乏有效的臨床治療手段。近來研究發現，血液中的某些生物標志物能夠反映腦梗死病理生理變化情況，且它們在血液中表達水平的變化可能影響腦血管病的疾病進展、嚴重程度及疾病轉歸，在腦血管疾病的早期診斷、病因識別、個體化治療中具有重要臨床價值[3]。本研究旨在評估急性腦梗死患者血清miR-21和缺氧誘導因子(HIF)-1α、血管內皮生長因子(VEGF)-A的表達變化及關系，以期為急性腦梗死的臨床診療提供一定參考價值。

材料與方法

1.一般資料：選取筆者醫院2016年5月～2017年5月于神經內科治療的急性腦梗死患者63例作為研究組，其中男性36例，女性27例，患者年齡49～83歲，平均年齡61.59±8.13歲。納入標準：①急性腦梗死診斷符合第4次全國腦血管病會議急性腦梗死的臨床診斷標準；②所有患者均經頭顱CT或頭顱MRI確診；③患者均為首次發病入院；④所有患者均知情同意[4]。排除標準：①重大手術或有嚴重外傷；②急性腦卒中病史；③神經系統功能障礙；④惡性腫瘤患者。另選同期于筆者醫院體檢健康者60例作為對照組，其中男性34例，女性26例，年齡48～80歲，平均年齡58.96±9.21歲。本研究經筆者醫院醫學倫理學委員會批準。

2.標本采集：腦梗死患者分別于發病后1、3、5、7、10天抽取空腹靜脈血3ml，對照組清晨抽取空腹靜脈血3ml。采集血樣置于EDTA抗凝管中，3000r/min離心10min后，分離血清，于-80℃冰箱中保存。

3.腦梗死患者評分標準及分組：所有腦梗死患者于發病后2～3天內進行頭顱CT或MRI檢查，根據Pullicino公式，計算腦梗死灶面積[5]。腦梗死面積=長×寬×陽性掃描層數×π/6，其中長為梗死灶最大長徑，寬為與長徑垂直的直徑。根據腦梗死病灶面積，將患者分為3組：梗死面積<4cm3，記為小梗死組，31例；梗死面積4～10cm3，記為中梗死組，21例；梗死面積>10cm3，記為大梗死組，11例。

4.熒光實時定量PCR法(RT-PCR)：采用熒光實時定量PCR法(RT-PCR)檢測血清中miR-21表達水平。應用RNA提取試劑盒(美國Digma-Aldrich公司)提取血清總RNA，采用反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)進行反轉錄。U6 snRNA作為內源對照。本研究所有引物設計均交由上海生工公司合成。使用ABI PCR System7300擴增儀進行PCR反應，根據基因特異性引物分析miR-21表達。用2-ΔΔCt法計算miR-21相對表達水平。PCR反應體系：使用50μl PCR反應體系，10X Buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl,，taq酶0.5μl，Pmix2.5μl，上游引物和下游引物各1μl，ddH2O 36μl。PCR反應條件：94℃預變性2min，隨后于94℃變性25s，60℃退火35s，72℃延伸20s，進行31個循環擴增PCR產物。取10μl PCR產物，應用Bio-Rad全自動電泳儀(USA)進行2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色。miR-21擴增引物設計如下：上游引物：5′-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3′；下游引物：5′-GGGCCTCACCTCTATGGTG-3′。

5.酶聯免疫吸附(ELISA)：應用酶聯免疫吸附法檢測血清HIF-1α與VEGF-A濃度。HIF-1α與VEGF-A特異性ELISA檢測試劑盒購自云南精賽頓生物制劑公司。所有操作嚴格按照試劑盒說明書進行。詳細步驟如下：首先從平衡至室溫的盒子中取出樣品，其余部分置于4℃冰箱中。除空白孔外，將樣品(100微升/孔)以及不同濃度的標準物質(100微升/孔)分別加入孔中，反應孔用膠紙密封。37℃溫育浴90min后，將板洗滌4～6次。之后，用紙交將板干燥。除空白孔外，所有其他孔與生物素抗體(100微升/孔)混合，37℃反應30min。將板洗滌4次后，進行避光孵育20min。之后，每個孔依次加入100微升終止反應液混合以結束反應。將反應板放入酶標儀(BioTek Instruments，Burlington，VT)中，測量A450值。根據樣品的A值對HIF-1α與VEGF-A含量進行計數，然后乘以樣品的稀釋比，獲得樣品HIF-1α與VEGF-A的實際濃度。將平均值作為相對數量。

結 果

1.兩組受試者一般臨床資料比較：兩組患者性別、年齡、吸煙、喝酒等一般資料以及臨床血液生化指標比較，差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組受試者一般臨床資料比較

2.兩組受試者血清miR-21、HIF-1α和VEGF-A水平變化比較：與對照組比較，在1、3、5、7、10天，研究組血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。在急性腦梗死發作后1天，患者血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表達水平達到最高，隨著發病后時間的延長(1天→3天→5天→7天→10天)，研究組患者血清miR-21、HIF-1α、VEGF-A表達水平均逐漸降低。詳見表2。

3.急性腦梗死患者不同體積組血清miR-21表達水平變化：研究組患者在急性腦梗死發作后的1、3、5、7、10天，與小梗死組比較，中梗死組患者血清miR-21表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與中梗死組比較，大梗死組患者血清miR-21表達水平均顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05，表3)。

4.急性腦梗死患者不同體積組血清HIF-1α表達水平變化：研究組患者在急性腦梗死發作后的1、3、5、7、10天，與小梗死組比較，中梗死組患者血清HIF-1α表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與中梗死組比較，大梗死組患者血清HIF-1α表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05，表4)。

表2 兩組受試者血清miR-21、HIF-1α和VEGF-A水平變化比較

表3 急性腦梗死患者不同體積組血清miR-21表達水平變化

表4 急性腦梗死患者不同體積組血清HIF-1α表達水平變化

5.急性腦梗死患者不同體積組血清VEGF-A表達水平變化：研究組患者在急性腦梗死發作后的1、3、5、7、10天，與小梗死組比較，中梗死組患者血清VEGF-A表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與中梗死組比較，大梗死組患者血清VEGF-A表達水平顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05，表5)。

表5 急性腦梗死患者不同體積組血清VEGF-A表達水平變化

6.急性腦梗死患者血清miR-21和HIF1-α、VEGF-A水平的相關性分析：Spearman相關性分析顯示，研究組患者發病后，血清miR-21與HIF-1α水平呈明顯正相關(r=0.515，P<0.05)，miR-21與VEGF-A水平呈明顯正相關(r=0.553，P<0.05)，HIF-1α與VEGF-A水平呈明顯正相關(r=0.726，P<0.05，圖1)。

圖1 急性腦梗死患者血清miR-21和HIF-1α、VEGF-A水平的相關性分析

討 論

微小RNA(miRNA)是長21～25nt的非編碼RNA分子，其通過靶向結合mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)來抑制轉錄和轉錄后水平的基因表達，從而參與調節人類胚胎發育、細胞分化、代謝、腫瘤形成等多種生物學過程。miRNA具有廣泛的基因調節能力，每種miRNA可以調控多個靶基因，同樣，每種mRNA也可以受多種miRNA調節，這種復雜的調節網絡使miRNA表現出多樣性功能，從而參與多種信號轉導通路。最近研究發現，在腦血管疾病的發生、發展過程中，miRNA廣泛參與動脈粥樣硬化、腦缺血缺氧耐受、腦水腫、神經保護等多種病理生理過程[6，7]。

大量動物和臨床研究發現，miRNA表達譜在發生腦卒中的腦組織和血液中呈現異常變化，提示miRNA參與腦卒中的病理生理過程。Jeyaseelan等[8]發現，大鼠缺血再灌注后腦組織中多種miRNA表達譜發生特異性變化，且在缺血腦組織中高表達的miRNA可在血液中檢測到，其變化與腦缺血損傷的生物標志物基質金屬蛋白酶-9變化一致。Liu等[9]發現，成年大鼠腦梗死后，腦組織和血清內miR-298、miR155、miR3256等多種miRNA表達水平均顯著上調或下調。這些結果均顯示，腦梗死后，血液內miRNA和腦組織內miRNA變化一致，即血清中miRNA的變化可以反映腦組織中miRNA變化，提示，血清miRNA水平的變化可以作為腦梗死的潛在新型生物標志物。Gan等[10]發現，腦梗死患者血液中miR-145表達水平明顯增加，高表達的miR-145通過促進神經嵴干細胞向血管平滑肌細胞表型轉化，從而促進血管內皮細胞重建，并提出miR-145可能成為第1個缺血性腦卒中的潛在血清生物標志物。Zeng等[11]發現，急性腦梗死患者外周血miR-210表達水平顯著降低，且在患病后第7天和14天變化明顯，并提出miR-210動態變化與患者腦梗死嚴重程度有關。Tsai等[12]發現，缺血性腦血管疾病患者的血清中miR-21表達水平顯著升高，可能作為預測腦血管疾病的潛在生物標志物。與此一致，本研究發現急性腦梗死患者血清miR-21水平顯著增加，血清中miR-21的增加可能預示著急性腦梗死的發生。在腦梗死急性期的同一時間點，隨著腦梗死面積的增加，miR-21表達水平逐漸增加，這提示miR-21在急性腦梗死患者血清中表達水平的增加與疾病嚴重程度有關，有可能作為急性腦梗死的潛在生物標志物。

缺氧誘導因子(HIF-1)是目前發現唯一在特異性缺氧狀態下發揮活性的轉錄因子。研究表明，腦梗死的病理過程中，腦組織由于缺氧而產生較高水平HIF-1，HIF-1進一步與其亞單位結合，形成有活性的HIF-1α并分泌致血液中，使外周血HIF-1α水平增加，并激活相關靶基因的轉錄，使血管內皮生長因子(VEGF)及其他下游因子表達水平增加，從而修復損傷血管的內皮，促進新生血管形成，并刺激紅細胞再生[13]。HIF-1作為低氧應答時基因表達和恢復內環境穩定的調節中心，腦梗死后其表達水平的增加對機體起積極保護作用，以減輕缺血、缺氧后的不良反應[14～16]。VEGF作為HIF-1轉錄因子的下游靶基因，在新血管形成之前對神經組織起直接保護作用。研究發現，機體缺氧時，HIF-1α激活VEGF的轉錄，從而使VEGF的生物活性增加。在缺血導致的腦組織損傷中，VEGF活性的增加能夠促進內皮細胞的增殖、遷移和新血管生成[17,18]。這些研究提示，在腦梗死后，HIF-1與VEGF在分子水平上的變化，使機體對缺血環境產生適應性變化，以減輕缺血、缺氧對機體的損傷。

李建軍等[19]發現，急性腦梗死患者發病后1、3、7天，血清HIF-1α和VEGF水平均顯著增加。與此一致，廖彬等[20]發現，急性腦梗死患者發病后1天，HIF-1α和VEGF表達水平達到高峰，在3、5、7、14天，HIF-1α表達水平雖逐漸降低，但仍顯著高于對照組。本研究發現，急性腦梗死患者發病1、3、5、7、10天后，血清HIF-1α和VEGF-A表達水平均顯著高于對照組，與以往研究結果一致。

譚新杰等[21]發現，在成年大鼠局灶性腦梗死的治療中，HIF-1α基因治療能夠通過修復和保護腦組織神經元，降低腦梗死面積而發揮急性腦梗死治療作用。Yang等[22]發現，VEGF表達水平的降低能夠使腦缺血引起的梗死體積增加，并提出內源性VEGF在缺血腦組織中表達水平的增加與神經保護作用有關。這些研究提示腦梗死面積與HIF-1α和VEGF表達水平的變化有關。本研究發現，在腦梗死急性期的同一時間點，腦梗死面積越大，HIF-1α和VEGF表達水平越高，提示腦梗死病灶面積可能影響血清HIF-1α和VEGF的表達水平。進一步進行相關性分析發現，HIF-1α與VEGF-A呈明顯正相關。這些結果表明，梗死面積越大，腦細胞及周圍腦組織水腫程度和缺氧狀況越嚴重，從而導致HIF-1α被大量激活，患者血清HIF-1α含量上升越明顯，進而刺激其下游靶點VEGF的轉錄，使VEGF-A表達水平逐漸增加。

大量研究已證實miR-21與缺氧有關[23]。Song等[24]發現miR-21過表達能夠使PTEN降低、p-Akt升高，隨后使HIF-1α表達增加，而miR-21抑制則導致PTEN升高、p-Akt降低，從而使HIF-1α降低，推斷HIF-1α表達水平的上調與miR-21的過表達有關。與此一致，Liu等[25]發現在缺氧條件下，miR-21通過調控PTEN/Akt信號途徑調節HIF-1α表達。陳惠軍等[26]發現在缺血缺氧情況下，miR-21表達水平上調，使HIF-1α表達上調，從而發揮腦組織保護作用。本研究進行相關性分析發現，在急性腦梗死患者中，miR-21與HIF-1α及VEGF-A表達水平均呈顯著正相關。結合過往研究推測，在腦梗死急性發作期，患者腦組織出現缺血缺氧情況，miR-21表達的上調使HIF-1α表達水平增加，HIF-1α作為轉錄因子，激活VEGF基因轉錄，從而使VEGF表達水平增加，從而使機體對缺血環境產生適應性變化。

綜上所述，在急性腦梗死患者血清中miR-21、HIF-1α和VEGF表達水平的增加與疾病嚴重程度有關，且三者在急性腦梗死中存在相關性，可作為判斷腦損傷的潛在生物學標志物。