血清25羥維生素D、YKL-40檢測在診治兒童難治性支原體肺炎中的臨床意義

任彥紅 陳 丹 張廣超 郭 青 沈照波 孫曉敏

肺炎支原體肺炎(mycoplasmapneumoniaepenumonia，MPP)是由于感染肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)導致兒童呼吸系統肺等產生炎癥的一種常見非典型性肺炎。其中大多數支原體感染導致的肺炎病情較輕，對大環內酯類抗生素敏感，療效好，但由于MP病原菌耐藥性、多種病原混合感染和患兒免疫功能損傷等因素，導致某些支原體肺炎患兒較為難治[1]。流行病學研究表明，近年來兒童難治性肺炎支原體肺炎(refractory MPP，RMPP)在獲得性肺炎病例中比例明顯增高，其在兒童疾病中致死率也相對升高[2]。然而，關于RMPP的致病原因尚不完全明確，臨床治療顯示在感染早期采用糖皮質激素進行治療，有利于抑制MPP疾病進展，控制病情[3]。因此，盡早準確診斷對于及時進行治療、減少RMPP發生、改善患兒預后具有重要臨床意義。研究發現，血清中25羥維生素D[25-hydroxy vitamin D，25(OH)D]含量是衡量人體內維生素D水平的有效指標，一定程度上可反映人體免疫水平；甲殼質酶蛋白40(YKL-40)是巨噬細胞、血管平滑肌細胞等合成、釋放的分泌型蛋白質，在機體處于炎癥狀態時其血漿水平升高，可反映機體炎癥狀態[4，5]。然而其在RMPP早期診斷中的作用尚不清楚。因此，本研究通過檢測MPP患兒血清中25(OH)D、YKL-40水平并進行分析，旨在探究二者對兒童RMPP的早期診斷價值。

材料與方法

1.一般資料：選取2016年4月～2018年1月筆者醫院收治的肺炎支原體肺炎患兒107例為研究對象，據RMPP診斷標準將MPP患兒分為普通支原體肺炎(ordinary MPP，OMPP)組67例，難治性支原體肺炎(RMPP)組40例。MPP診斷標準按照《實用兒科學》第7版相關診斷標準：患兒劇烈持續性咳嗽，胸片顯示兩肺有斑片或點網狀陰影，白細胞計數正常或稍微偏高，大環內酯類抗菌藥物對其治療效果好，MP特異性抗體IgM呈陽性[6]。RMPP診斷標準根據《兒科難治性疾病管理指南》(2013年)中標準進行評定：采用大環內酯類抗菌藥物正規治療超過1周，咳嗽、發熱等臨床癥狀未減輕，呈進行性加重，肺外其他系統出現并發癥，且胸片顯示肺部陰影加劇的MPP患兒即可診斷為RMPP[7]。MPP患兒納入標準：①符合MPP診斷標準且排除其他造成肺部感染病因的患兒；②患兒年齡5～12歲；③病程≤7天；④一般資料及病理資料完整患兒。排除標準：①合并其他病原菌感染患兒；②合并有反復呼吸道感染、先天性免疫缺陷疾病患兒；③病程超過7天患兒；④肺炎恢復期住院患兒；⑤中途未遵醫囑進行治療患兒。選取同期與筆者醫院門診進行體檢的健康兒童55例為對照組。本研究通過筆者醫院道德倫理委員會批準并取得患兒家屬知情同意。

2.臨床資料收集：記錄所有MPP患兒一般資料及臨床資料，包括患兒年齡、性別、住院時病程、發熱時間、肺外并發癥、肺部啰音、呼吸音情況、胸腔積液情況、肺部壞死性炎癥情況等資料。

3. 血清25(OH)D及YKL-40蛋白水平檢測：于入院2h內采集所有MPP患兒靜脈血(2毫升/人)，4℃下，3000r/min離心10min，收集上層血清，采用人25(OH)D ELISA試劑盒(貨號：SBJ-H1130，南京森貝伽生物公司)、人YKL-40 ELISA試劑盒(貨號：CSB-E13608h，武漢華美生物工程公司)檢測各患兒血清中25(OH)D、YKL-40水平，具體步驟如下：①將特異性抗體球蛋白用包被緩沖液稀釋至5μg/ml，每凹孔加0.4ml，4℃過夜；②緩沖液洗3次，加入0.2ml血清，37℃孵育60min；③緩沖液洗3次，加入酶標抗體anti-25(OH)D、anti-YKL-40，37℃孵育60min；④緩沖液洗3次后，加入0.2ml酶的作用底物，室溫孵育30min；⑤加0.05ml檸檬酸(2mol/L)終止反應，檢測492nm下吸光度(A)值。

結 果

1.MPP患兒與健康兒童血清25(OH)D、YKL-40水平的比較：與對照組健康兒童比較，MPP組支原體肺炎患兒血清中25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表1。

2.血清25(OH)D、YKL-40水平對MPP的診斷價值：ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D、YKL-40水平表現出對MPP患兒與健康兒童較強的區分能力。血清25(OH)D對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.732，95%CI：0.679～0.881(P<0.05)，以21.09ng/ml為截斷值診斷MPP敏感度為56.97%，特異性為82.86%，詳見圖1A；血清YKL-40對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.679，95%CI：0.536～0.791(P<0.05)，以36.57ng/ml為截斷值診斷MPP敏感度為50.79%，特異性為78.58%，詳見圖1B。

表1 MPP患兒與健康兒童血清25(OH)D、YKL-40水平的比較

圖1 血清25(OH)D、YKL-40水平對MPP診斷的ROC曲線分析

3.血清25(OH)D、YKL-40水平與MPP患兒臨床病理特征的關系：根據ROC曲線所取截斷值將MPP患兒分為25(OH)D高水平組43例、25(OH)D低水平組64例和YKL-40高表達組62例、YKL-40低表達組45例。25(OH)D低水平者肺炎患兒肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥等發生率明顯高于25(OH)D高水平者(P<0.05)；25(OH)D低水平者肺炎患兒的性別構成、年齡構成、發熱時長、肺外并發癥發生率與25(OH)D高水平者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。YKL-40高表達者肺炎患兒中肺外并發癥、肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥等發生率明顯高于YKL-40低表達者，差異有統計學意義(P<0.05)；YKL-40高表達者肺炎患兒的性別構成、年齡構成、發熱時長與YKL-40低表達者比較，差異無統計學意義(P>0.05),詳見表2。

4.RMPP患兒與OMPP患兒血清25(OH)D、YKL-40水平比較：與OMPP組肺炎患兒比較，RMPP組患兒血清25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05),詳見表3。

5.血清25(OH)D、YKL-40水平對RMPP的診斷價值：ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D、YKL-40水平表現出對RMPP患兒和OMPP患兒較強的區分能力。血清25(OH)D對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.751，95%CI：0.614～0.877(P<0.05)，以18.57ng/ml為截斷值診斷RMPP敏感度為55.95%，特異性為81.66%，詳見圖2A；血清YKL-40對MPP患者診斷的ROC曲線下面積為0.797，95%CI：0.683～0.954(P<0.05)，以38.59ng/ml為截斷值診斷RMPP敏感度為63.76%，特異性為84.07%，詳見圖2B。

討 論

RMPP一般指經大環內酯類抗生素治療7天以上，未見明顯療效者，是MPP疾病中較為難治的一種。近年來，隨著β內酰胺類抗生素的推廣使用，兒童RMPP發生率逐年升高。RMPP疾病病程進展迅速，易引發肺壞死等嚴重肺內并發癥，對患兒心臟、肝臟、腦等多器官造成損傷，導致多器官功能障礙，嚴重者進展為壞死性肺炎，甚至死亡[8]。研究發現，對早期RMPP患兒加用糖皮質激素進行治療，可有效控制肺炎病情發展，改善患兒預后，治療效果明顯[3]。因此，探索與RMPP發生、發展相關的生物標志物，尋找敏感度、特異性較高的RMPP診斷生物標志物，可為早期精確診斷、后期靶向治療及改善RMPP患者預后提供新思路。

表2 血清25(OH)D、YKL-40水平與MPP患兒臨床病理特征的關系

表3 RMPP患兒與OMPP患兒血清25(OH)D、YKL-40水平比較

維生素是維持人和動物正常生理功能的一類微量有機物，自身不可合成產生，依靠從食物中攝取，在人體生長、發育及代謝等生物過程中具有重要作用[9]。其中維生素D是一類脂溶性固醇類維生素，其活性形式為1,25(OH)D半衰期很短，在人體血清中多以穩定的前提形式25(OH)D存在，一定程度上可反映人體維生素D狀態[10]。鄧永超等[11]研究發現，維生素D水平較低的兒童，免疫力較低，COX分析顯示，維生素D水平較低是兒童發生肺炎的獨立危險因素，重癥肺炎患兒肺內皮細胞中25(OH)D水平顯著低于輕癥患兒，提示維生素D水平較低是影響肺炎由輕癥進展為重癥的因素之一。

Thuesen等[12]研究發現，25(OH)D低水平哮喘患者FEV1%等肺功能較低，提示25(OH)D與哮喘患者肺功能有關。另外，Rathored等[13]發現，耐多藥性結核病患者血清25(OH)D水平顯著低于普通結核患者。MPP發病的根本原因即在于機體免疫水平低，免疫系統不能成功抵御支原體病菌感染，因此本研究推測血清25(OH)D水平可能與MPP疾病發生有關。本研究發現，MPP患兒血清中25(OH)D水平明顯低于健康兒童，表明25(OH)D水平較低可能是MPP疾病發生的原因之一。ROC曲線分析顯示，血清25(OH)D對MPP患者診斷的AUC為0.732，表明血清25(OH)D水平對MPP患兒和健康兒童之間有較強的區分能力，提示檢測兒童血清25(OH)D水平能較準確地診斷MPP疾病。進一步研究發現，血清25(OH)D水平與MPP患兒肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥發生率有關，提示25(OH)D可能參與MPP疾病進展。

圖2 血清25(OH)D、YKL-40水平對RMPP診斷的ROC曲線分析

甲殼質酶蛋白40是一種由巨噬細胞、血管平滑肌細胞等合成、釋放的分泌型蛋白質，因其N端起始氨基酸為酪氨酸(tyrosine，Y)、賴氨酸(lysine，K)和亮氨酸(leucine，L)而被稱為YKL-40[14]。研究表明，機體中YKL-40過表達在多種炎癥相關疾病發生、發展中具有重要作用，參與調解炎性相關因子表達、細胞增殖、組織重塑等生理病理過程[15]。Corradi等[16]發現，非小細胞肺癌患者血清YKL-40濃度顯著升高，檢測血清YKL-40水平可顯著提高肺癌的診斷特異性。Korthagen等[17]發現，循環YKL-40水平在纖維性間質性肺炎中顯著升高，與纖維化程度和炎癥的活動程度有關，提示血清YKL-40水平可能與肺部病變的發生、發展有關，但YKL-40在MPP疾病中作用尚不清楚。本研究發現，MPP患兒血清中YKL-40蛋白水平顯著高于健康兒童，血清YKL-40對MPP患者診斷的AUC為0.679，表明血清YKL-40蛋白水平對MPP患兒和健康兒童之間有一定區分能力，提示檢測兒童血清25(OH)D水平可能較準確地診斷MPP疾病。進一步研究發現，血清YKL-40蛋白水平與MPP患兒肺外并發癥、肺部啰音、呼吸音低、胸腔積液、肺部壞死性炎癥發生率有關，表明血清YKL-40蛋白水平與MPP疾病嚴重程度有關，提示YKL-40參與MPP疾病進展。

根據RMPP診斷標準，可將MPP患兒分為OMPP患兒和RMPP患兒，其中RMPP患兒常常伴隨肺內及肺外多臟器并發癥，導致多器官衰竭，病死率更高，治療的重點在于早期糖皮質激素藥物的介入處理和感染的及時有效控制[18]。因此，RMPP的準確診斷有利于區分OMPP和RMPP患者，從而盡早給與合理干預，控制患兒病情進程，改善預后。本研究發現與OMPP組肺炎患兒比較，RMPP組患兒血清25(OH)D水平明顯降低，YKL-40蛋白水平顯著升高，表明25(OH)D、YKL-40可能與RMPP發生相關。ROC曲線分析發現，血清25(OH)D、YKL-40水平表現出對RMPP患兒和OMPP患兒較強的區分能力，且血清25(OH)D對MPP患者診斷的AUC為0.751，血清YKL-40對MPP患者診斷的AUC為0.797，敏感度及特異性較高，提示檢測MPP患者血清25(OH)D、YKL-40水平可用于RMPP的初步診斷，且血清YKL-40水平對RMPP的診斷價值更高。然而25(OH)D、YKL-40在MPP疾病發生、發展中作用機制仍不明確，將在后續研究中進行探究。

綜上所述，MPP患者血清25(OH)D水平較低，YKL-40水平較高，二者對MPP具有較高診斷價值，且在OMPP患兒和RMPP患兒中呈現顯著差異，對RMPP的診斷具有一定價值，推測檢測血清25(OH)D、YKL-40水平可能應用于RMPP的診斷和早期篩查。