內臟神經對犬急性壞死性胰腺炎肺損傷的影響

王 杜 孫君軍 劉偉峰 楊延輝 褚智杰 楊 成 楊天保 桂 洋

急性壞死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis，ANP)是種起病急、病情變化快，病因復雜、病死率高的臨床常見急危重癥，其對生命的威脅，不僅在疾病本身，更在于ANP時炎性因子激活后的炎癥級聯放大反應，波及全身而引起嚴重并發癥，其中以急性肺損傷(acute lung injury，ALI)為最常見的早期并發癥[1,2]。有關ANP及其并發癥治療的研究多從體液調節的角度出發，2000年有研究人員提出膽堿能抗炎通路的新概念，強調神經系統在抗炎過程中的重要作用，這為ANP抗炎治療提供了新思路[3, 4]。本研究通過檢測實驗動物模型血清P、E選擇素等生化指標變化，結合肺組織病理，探索內臟大神經在ANP急性肺損傷時的保護作用。

材料與方法

1.實驗動物與試劑：健康雄性(1～2周歲)雜種犬24只，體重10～15kg，購于河南科技大學實驗動物中心，實驗動物許可證號：SYXK(豫)2016-0010，對實驗動物的處理經河南科技大學動物倫理學委員會討論通過。按照隨機數字表法將犬分為假手術組(SO組)8只；急性壞死性胰腺炎模型組(ANP組)8只，實驗途中死亡2只；ANP+內臟大神經切斷組(GSNT組)8只。實驗途中死亡犬放棄數據統計。?；悄懰徕c及胰蛋白酶購于美國Sigma公司，P-selectin、E-selectinELISA試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司。

2.術前準備：備皮，剃去腹部及前后肢毛發；測量體重。術前禁食12小時，自由飲水。實驗前1h配置?；悄懰徕c和胰蛋白酶混合制劑。

3.模型制作：術前15min肌注硫酸阿托品(0.1mg/kg)，舒泰50(15mg/kg)肌注誘導麻醉。犬麻醉成功后取仰臥位固定于動物實驗手術臺，前肢置入靜脈留置針1枚，丙泊酚[15mg/(kg·h)]泵入以術中維持麻醉狀態。腹部常規消毒鋪巾，取腹部正中切口，逐層進入腹腔，無菌濕紗布保護切口，GSNT組暴露雙側腎上腺并細心解剖分離腎上腺后上方內臟大神經，掛線標記以備用，SO組、ANP組免去掛線步驟。隨后各組均在距幽門10～12cm處十二指腸前外側壁做2cm縱行切口，充分顯露可于腸腔內后壁黏膜面見一直徑1.0～1.5mm白色臍樣凹陷，即為副乳頭(主胰管開口處)，沿此置入硬膜外麻醉導管(1.0mm)，進深5cm左右。固定硬膜外導管后，ANP、GSNT組經微量泵向主胰管內以7.6kPa恒定壓力注入5%?；悄懰徕c(0.5ml/kg)和胰蛋白酶(3000U/kg)混合制劑誘導ANP，注射完畢后，觀察5min，見胰腺組織出現點狀或片狀出血、壞死，提示模型初步建立；SO組經微量泵以相同壓力及泵速注入等量生理鹽水。拔除導管仔細橫行縫合腸壁切口。GSNT組再次觀察5min，提起掛線剪斷雙側內臟大神經。最后逐層關閉腹部切口，消毒包扎。術中均以動物實驗用心電信號采集系統進行心電監護。

4.術后維護支持及管理：全部動物制模完成后，禁食、禁飲。放置于清潔循環良好標準動物實驗室內，專人陪護，觀察犬生命體征變化及手術切口。經留置針完全腸外營養支持，按非蛋白熱量50kcal/(kg·d)和含氮量0.3g/(kg·d)，總補液量為60ml/(kg·d)比例補液，并補足每天體液丟失量。觀察并記錄動物心率、呼吸等生命體征，記錄24h尿量、大便次數及性狀，惡心、嘔吐情況，以及精神狀況。

5.標本采集與檢測方法：分別于術前2h、術后12h、24h、3天、5天、7天采集外周靜脈血3ml，1ml用于淀粉酶、白蛋白(試劑盒由河南科技大學臨床醫學院檢驗科提供)測定；2ml血液肝素抗凝，高速離心后取上清液置于EP管中，-80℃冰箱保存，用ELISA試劑盒和酶標儀測定A值后計算血清P-selectin、E-selectin水平。術后第7天統一處死實驗犬，取胰腺、肺組織標本行病檢及病理學評分。胰腺病理學評分以改良Schmidt為評價標準，觀察組織水腫、壞死、出血、炎癥對胰腺損傷進行病理學計分[5, 6]。參照 Hofbauer等[7]方法，觀察肺組織水腫、炎性細胞浸潤和出血對肺損傷進行病理學計分。

結 果

1.術前2h各組檢測結果比較：術前2h 3組AMY、ALB、P-selectin及E-selectin血清濃度檢測結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，各組間具有可比性(表1)。

表1 術前2h 3組血清淀粉酶、白蛋白、P選擇素、E選擇素檢測

2.術后各時間點3組血清AMY水平比較：ANP組、GSNT組血清AMY水平與SO組比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組與GSNT組比較，差異無統計學意義(P=0.121)；ANP組與GSNT組AMY水平于術后第1天出現峰值，隨后檢測呈下降趨勢；SO組AMY水平無明顯波動(表2)。

表2 術后各時間點3組血清AMY檢測

3.術后各時間點3組血清ALB水平比較：ANP組、GSNT組血清ALB水平與SO組比較明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組與GSNT組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；ANP組、GSNT組術后血清ALB水平均呈下降趨勢(表3)。

表3 術后各時間點3組血清ALB檢測

4.術后各時間點3組血清 E-selectin水平比較：ANP組、GSNT組血清E-selectin水平與SO組比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組血清E-selectin水平較GSNT組升高明顯(P<0.05)，差異有統計學意義(表4)。

表4 術后各時間點3組血清E-selectin檢測

5.術后各時間點3組血清P-selectin水平比較：ANP組、GSNT組血清P-selectin水平與SO組比較明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組血清P-selectin水平較GSNT組升高明顯，差異有統計學意義(P<0.05)(表5)。

表5 術后各時間點3組血清P-selectin檢測

6.胰腺及肺組織病理變化：(1)胰腺光鏡下病理改變：SO組胰腺組織光鏡下結構基本正常(圖1A)；ANP組胰腺腺泡水腫，小葉結構破壞，大量炎性細胞浸潤，組織出血、壞死明顯(圖1B)；GSNT組散在炎性細胞浸潤，出血、壞死及小葉結構破壞情況較ANP組輕(圖1C)。(2)肺組織光鏡觀察：SO組肺組織光鏡下無明顯病變，肺泡結構清晰(圖2A)；ANP組光鏡下可見肺泡壁水腫增寬，間質血管充血、出血明顯，炎性細胞浸潤(圖2B)；GSNT組肺泡壁水腫，間質血管充血、出血，炎性細胞浸潤，病變情況較ANP組輕(圖2C)。(3)胰腺組織病理評分：SO組病理評分明顯低于其他兩組，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組評分明顯高于GSNT組，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。(4)肺組織病理評分：SO組病理評分明顯低于其他兩組，差異有統計學意義(P<0.05)；ANP組評分明顯高于GSNT組，差異有統計學意義(P<0.05)(圖4)。

7.實驗中途犬死亡情況：SO組、GSNT組實驗途中無犬死亡情況；ANP組實驗中途死亡兩只，立即進行尸體解剖。1只于第3天因感染性休克死亡，1只于第4天死于肺損傷所致呼吸衰竭。

圖1 各組胰腺組織光鏡下病理改變(HE,×200)

圖2 各組肺組織光鏡下病理改變(HE,×200)

圖3 3組胰腺組織病理學評分與SO組比較,*P<0.05；與ANP組比較，#P<0.05

圖4 3組肺組織病理學評分與SO組比較,*P<0.05；與ANP組比較，#P< 0.05

討 論

ANP時多種炎性介質及細胞因子間級聯反應使胰腺局部炎癥進展至全身炎性反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)、 多臟器損傷，最終致MODS[8, 9]。肺是病理進展中最先累及的胰腺外器官，表現為急性肺損傷(ALI)。中性粒細胞是引起肺損傷的主要效應細胞，炎性反應時P選擇素、E選擇素參與并啟動了中性粒細胞與內皮細胞的接觸與黏附，使中性粒細胞在肺中大量“滯留”，后者可通過釋放其他炎性介質，激活肺血管內皮細胞表達選擇素進而形成“級聯反應”，加重肺組織損傷[10～12]?？梢哉f，ANP病程進展中，P選擇素、E選擇素介導的黏附過程對炎性反應擴布起到了重要作用。

ANP時機體炎性反應失控、應激反應，交感神經張力高于迷走神經。前者參與調控炎性反應的通路主要為“下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPAA)”， HPAA是人體內分泌系統重要組成部分，亦是“神經-內分泌-免疫網絡”的重要體現[13]。過度興奮的交感神經可導致血清糖皮質激素、兒茶酚胺等水平升高，進而引起淋巴細胞增殖減少、NK細胞活性下降、抗體生成水平降低等免疫改變，致機體免疫反應降低[14]。過去的研究強調抗炎機制是通過體液途徑來實現的，自Borovikova等[3]在2000年首次提出 “膽堿能抗炎通路”的概念至今，更多的研究證實神經系統可參與調控炎癥反應并能起到重要作用[15～17]。因此膽堿能抗炎通路的發現，不僅建立了神經系統與免疫系統之間的聯系，更為治療ANP時失控的炎性反應提供了一個新思路。

本研究以犬為研究對象建立ANP模型，采用離斷腹腔雙側內臟大神經達到減低交感神經張力的作用，通過檢測血清P選擇素、E選擇素、淀粉酶、白蛋白水平以及胰腺、肺組織病理評分，認識神經系統對ANP時肺組織的影響。實驗發現術前2h各組血清AMY、ALB、P選擇素、E選擇素的水平差異無統計學意義，各組之間有可比性。造模后ANP組、GSNT組血清AMY、P選擇素、E選擇素濃度較SO組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，臨床工作中血清AMY升高常提示胰腺疾病，并且P選擇素、E選擇素在正常情況時低水平表達或不表達，而在急性炎癥早期中性粒細胞向受損部位趨集過程中表達明顯集中[18, 19]。因此，血清AMY、P選擇素、E選擇素水平的升高表明造模急性壞死性胰腺炎成功；術后ANP組與GSNT組各時間點AMY水平比較，差異無統計學意義，表明血清AMY水平與胰腺炎嚴重程度無關。ANP組、GSNT組術后血清ALB較SO組明顯降低，且ANP組、GSNT組血清ALB水平均呈下降趨勢，考慮其降低原因主要為ANP時因炎性反應周圍組織大量滲出，肝臟合成減少，應激反應分解代謝增強；血清ALB水平可作為評估ANP嚴重程度及判斷臨床預后的指標，與ANP嚴重程度呈正相關。ANP組術后各時間點血清P選擇素、E選擇素水平均明顯高于GSNT組，差異有統計學意義(P<0.05)。同時ANP組胰腺、肺病理評分明顯高于GSNT組，光鏡下可觀察到ANP組胰腺、肺組織損傷情況較GSNT組明顯。P選擇素、E選擇素的表達水平與細胞因子TNF-α的作用密切相關，離斷內臟大神經可降低ANP炎性反應時血清TNF-α的濃度，這可能與離斷內臟大神經后迷走神經相對興奮有關[20]。迷走神經感覺纖維在炎性反應刺激下，將炎性反應信息經迷走神經傳入支傳入神經中樞，經中樞神經系統處理后，迷走神經傳出支通過突觸的方式釋放乙酰膽堿可激活免疫細胞上膽堿能受體，降低TNF-α的濃度進而降低P選擇素、E選擇素表達水平，影響早期炎癥發生、發展中炎性細胞黏附-損傷過程；同時，激活的膽堿能抗炎通路能快速直接調節全身性炎性反應，而起到抑制炎性反應減輕組織損傷的作用。

本研究顯示，內臟大神經離斷能降低犬ANP時血清中P選擇素、E選擇素水平，減輕胰腺以及肺組織損傷程度，證實膽堿能通路在炎性性疾病中具有重要調節作用。隨著對ANP發病機制、神經抗炎機制認識的加深，進一步探討并找到無創調節交感-迷走神經張力平衡的方法是治療ANP時肺損傷的新方向。