siRNA沉默Skp2基因對肝癌HepG2細胞生物學行為影響及機制

郭云霞 秦寶山 馮軍安 韓 莉 王志凌 王郁杰

肝癌在我國發生率較高，而浸潤和轉移是該病惡化和死亡的重要原因[1，2]。研究表明，肝癌的發生與部分基因異常表達有關[3]。Skp2基因位于5p13，與多種惡性腫瘤發生、發展相關[4，5]，其中Skp2蛋白能特異性識別泛素連接酶復合物的底物，并將其磷酸化促進泛素化降解及細胞周期從G1期向S期過渡，導致細胞過度增殖[6]。已有研究表明，Skp2高水平者其預后差，多變量分析顯示，Skp2 mRNA表達水平可以作為肝癌患者獨立的預后指標[7，8]。然而目前Skp2基因沉默后調節肝癌細胞生物學行為中的分子機制仍然未知。本研究采用siRNA方法沉默Skp2的表達，研究其對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響。

材料與方法

1.實驗材料：人肝癌HepG2細胞(齊氏生物科技有限公司)。Skp2 Human siRNA(美國Origene公司)。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2X)(上海碧云天生物技術有限公司)。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。MMP2、MMP9 ELISA試劑盒(武漢博士德公司)；Lipofectamine TM2000 (美國Invitrogen公司)。兔抗人caspase-3、P27蛋白抗體、羊抗兔HRP標記的二抗(碧云天生物技術研究所)。

2.實驗方法： (1)組織標本的采集：選取2010年1月～2017年1月筆者醫院病理科明確診斷的16例肝癌組織標本。取同期配對且病理分析為正常組織的癌旁組織16例作為對照組。所有患者年齡在38～87歲，平均年齡為69.43±7.25歲。標本采集均告知患者并簽署知情同意書，并經筆者醫院倫理學委員會批準。(2)細胞培養和轉染：HepG2細胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化、傳代。將1×104個/ml細胞接種于6孔板培養，當細胞匯合度達80%以上時，將培養基換成無血清無雙抗的培養基，并根據Lipofectamine TM2000使用說明進行轉染細胞操作。37 ℃、5% CO2培養箱中培養6h后，PBS 洗去轉染試劑，改換含10%胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養。實驗分3組：對照組(僅有空載體)、NC-Skp2組(僅含有SKP2陰性序列)、siRNA-Skp2組(含有Skp2基因干擾序列)，每個實驗重復3次。(3) qRT-PCR：Trizol裂解人肝癌組織、癌旁組織或細胞系，4℃、12000g離心10min，吸取水相層，按每毫升最初的Trizol加入0.5ml異丙醇，4℃、12000g離心10min，棄上清，所得沉淀即為 RNA，并測定純度。按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄生成 cDNA。反應體系為20μl，其中BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix (2×)10μl，上游(3μmol/L)和下游(3μmol/L)2μl，cDNA2μl，PCR級高純水6μl。采用light cycleR96實時熒光定量PCR儀，反應條件：預變性95℃2 min ；95℃變性15s，60℃退火 25s，60℃延伸 30s，共40 個循環。引物序列由上海英駿公司提供。Skp2上游序列：5′-GCTGAACATTTCAGTACTCTCGC-3′，下游序列：5′-GTCTCTGACACATGCGCAAC -3′，產物大小194p；內參 GAPDH上游引物：5′-CCACTAGGCGCTCACTGTT-3′，下游引物：5′- TGGAATTTGCCATGGGTGGA -3′，長度228bp。SKP2相對表達量=2-△△Ct×100%，△Ct=Ct(待測基因)-Ct(GAPDH)。(4)CCK-8測定細胞活力：取對數生長期細胞，調整密度為1×104個/ml細胞接種于96孔板，每組設置3個復孔，培養24、48、72、96h，每孔加入CCK-8 10μl，培養2h各孔細胞在450nm測定吸光度A值，另設空白對照組調零，計算抑制率。實驗重復3次。(5)流式細胞儀檢測細胞凋亡：對數期HepG2細胞轉染72h后，胰酶消化，1000×g離心5min，收集細胞，PBS重懸計數，5×104重懸細胞，1000×g離心5min，加入結合液500μl重懸細胞，加入Annexin Ⅴ-FITC5μl，然后加入PI 5μl，混勻，室溫孵育10min，隨即行流式細胞儀檢測。(6) Transwell 小室檢測細胞的侵襲力：Transwell 上室膜面鋪上 Matrigel。將分組干預72h的細胞采用胰酶消化，調整，每孔上室加入細胞密度為4×104的無血清培養基100μl，每孔下室加入10%胎牛血清的RPMI1640培養基500μl，37℃、5%CO2培養箱中培養24h，棉簽刮凈濾膜上層細胞，100%多聚甲醛固定10min，染色，拍照計數。(7) ELISA法測定檢測 MMP2和MMP9水平：對數期HepG2細胞轉染72h后，收集細胞上清。等比稀釋標準品繪制標準曲線，每孔加入樣品和標準品100μl，置37℃孵育1.5h。每孔添加生物素標記抗體100μl，置37℃孵育1h。然后0.01mol/L TBS洗滌3次。每孔加過氧化物酶孵育1h， TMB37℃避光反應0.5h，加入TMB終止液，在ELISA檢測儀上，于450nm波長處，測各孔吸光度(A)值。(8)Western blot法檢測caspase-3、P27的表達：常規方法提蛋白質，調整各樣本蛋白總量，參照說明書進行SDS-PAGE凝膠電泳，參照規程分別孵育一抗和二抗，Bio-Rad凝膠成像系統成像拍照，以β-actin為內參分析待測蛋白相對表達值。

結 果

1.Skp2 mRNA在肝癌組織中的表達：利用qRT-PCR技術檢測肝組織中Skp2 mRNA表達水平，檢測結果顯示肝癌組織中Skp2 mRNA的相對表達量為3.68±1.47，癌旁組織為1.10±0.47，其中肝癌組織中Skp2 mRNA水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)。

2.siRNA-Skp2沉默HepG2細胞中Skp2的mRNA的表達：qRT-PCR結果顯示，空白對照組Skp2mRNA的相對表達量為2.42±0.06，NC- Skp2組為2.40±0.05。siRNA-Skp2組為1.07±0.05。與NC-Skp2組和空白對照組比較，轉染siRNA-Skp2后，siRNA-Skp2組的Skp2的mRNA表達明顯下調(P<0.05,圖1)。

3.轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞增殖的影響：CCK-8實驗結果顯示，與空白對照組和NC-Skp2組比較，轉染siRNA-Skp2后，siRNA-Skp2組的增殖率明顯下調(P<0.05)，而空白對照組和NC-Skp2組間比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖1)。

圖1 轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞活力的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

4.轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞凋亡的影響：采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，在轉染72h后，空白對照組、NC- Skp2組和siRNA-Skp2組的細胞凋亡率分別為3.12%±0.74%、3.83%±1.14%、20.42%±1.24%。與空白對照組和NC- Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細胞凋亡率明顯上調(P<0.05，圖2)。

5.轉染siRNA-Skp2對細胞的侵襲力的影響：采用Transwell 小室檢測細胞侵襲力，結果顯示，在轉染72h后，空白對照組穿膜細胞數為31.52±3.12；NC-Skp2組細胞數為30.27±1.42；siRNA-Skp2組細胞數為8.23±2.47。與空白對照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細胞侵襲力明顯下調(P<0.05，圖3)。

圖2 Skp2對HepG2細胞凋亡的影響

圖3 Skp2對HepG2細胞侵襲力的影響

6.轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞侵襲蛋白的影響：采用ELISA法檢測MMP2和MMP9水平，在轉染72h后，與空白對照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的細胞分泌MMP2和MMP9能力明顯下調(P<0.05，圖4)。

7.轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞中caspase-3、P27的表達影響：采用Western blot法檢測caspase-3、P27蛋白水平，在轉染72h后，與空白對照組和NC-Skp2組比較，siRNA-Skp2組的caspase-3、P27的表達水平明顯上調(P<0.05，圖5，圖6)。

討 論

Skp2 為F-box家族的成員，對細胞G1～S 期具有特異性的調控作用，并已被廣泛應用于實驗研究[9,10]。李勝等[11]采用Skp2 RNA干擾表達載體降低Skp2蛋白在肺癌細胞中的表達。結果表明，干預組細胞的肺癌細胞生長較陰性對照組明顯降低，而凋亡率較陰性對照組明顯增加。在喉癌組織中也觀察到相似的結果[12]。Xu等[13]通過沉默Skp2基因表達水平，膀胱癌T24細胞增殖和侵襲受到顯著抑制。目前，已有研究表明，Skp2在肝癌組織中的中的陽性表達明顯高于癌旁組織，但其機制并不太明確[8]。本研究結果顯示，Skp2 mRNA在肝癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織，這與相關研究一致。為了進一步研究Skp2在肝癌的進展中的作用，將體外合成的siRNA-Skp2轉染HepG2細胞72h后，采用qRT-PCR分析靶基因Skp2的mRNA水平變化。結果表明，siRNA-Skp2能有效降低Skp2基因表達。

圖4 轉染siRNA-Skp2對HepG2細胞侵襲蛋白的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

圖5 轉染siRNA-Skp2對caspase-3、P27蛋白表達的影響

圖6 轉染siRNA-Skp2對caspase-3、P27蛋白水平的影響與NC-Skp2組比較，*P<0.05

已有研究表明，P27低表達與高度侵襲性腫瘤相關，而P27高水平可以抑制癌細胞的增殖[14]。本實驗通過CCK-8實驗檢測了轉染siRNA-Skp2后HepG2細胞增殖的影響，結果表明siRNA-Skp2能有效的抑制HepG2細胞的增殖。而且實驗還觀察到轉染siRNA-Skp2 72h后，HepG2細胞中Skp2表達水平下調的同時，P27蛋白水平反而上升，這也間接說明Skp2可能通過P27蛋白信號通路調控細胞增殖。當然，腫瘤細胞能在機體內快速增值與細胞凋亡受到抑制也存在一定的關系。為了進一步研究Skp2對細胞凋亡的影響，本研究采用流式細胞儀分析了siRNA-Skp2轉染HepG2細胞后的凋亡情況。結果siRNA-Skp2可有效的促進HepG2細胞凋亡，提示Skp2在抗腫瘤細胞凋亡方面發揮著重要作用。而且siRNA-Skp2轉染72h后，凋亡蛋白caspase-3也顯著增加，表明Skp2下調后可通過caspase信號通路誘導HepG2細胞凋亡。

為了研究siRNA-Skp2轉染對HepG2細胞體外侵襲力的影響，本研究采用Transwell 小室檢測細胞侵襲力。結果顯示，siRNA-Skp2可有效降低HepG2細胞體外侵襲能力。已有研究表明，腫瘤細胞外基質的消化與腫瘤的侵襲有關[15,16]。腫瘤細胞分泌的MMP家族成員可以降解細胞外基質成分[17～19]。而且也有文獻顯示沉默Skp2后可下調MMP2和MMP9的分泌，進而抑制腫瘤的侵襲能力[20]。本研究通過MMP2和MMP9水平檢測也表明，轉染siRNA-Skp2后，HepG2細胞分泌MMP2和MMP9的能力明顯降低。因此，降低Skp2表達水平，可通過降低MMP2和MMP9的分泌，抑制肝癌的侵襲力。

總之， Skp2基因沉默后肝癌HepG2細胞增殖和侵襲能力下降，細胞凋亡增強，其機制可能與調控P27、caspase-3、MMP2和MMP9有關。因此，抑制Skp2的表達，也可能成為肝癌基因治療的新策略。