櫟樹繁殖生物技術(shù)研究進展

孟凡金

（遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧沈陽 110032）

近年來，在櫟樹繁育的過程中，人們已經(jīng)開始采用試管快速繁育技術(shù)、體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)，這有助于加快櫟樹繁殖速度，提升種子的繁育質(zhì)量，促進櫟樹的有效繁殖，為其后續(xù)發(fā)展夯實基礎(chǔ)。

1 試管繁育技術(shù)

櫟樹的試管快速繁育，通常需要利用無菌短枝進行扦插與叢生芽的繁殖處理。就目前的研究可知，合理選擇外植體是重點環(huán)節(jié)。在繁育之前，人們應(yīng)選擇再生能力較高的外植體，并做好無菌處理與消毒工作。其中，需要對初代培養(yǎng)所采用的外植體進行表面的消毒處理，如若頂芽與莖外已經(jīng)被絨毛附屬物包裹，可以采用流水沖洗2 h左右，然后使用毛刷清洗。如果將種子作為外植體，需要將其設(shè)置于工作臺上對種皮進行剝離處理，然后用0.2%多菌靈消毒30 min，也可以用0.05%氯化泵消毒10 min。對于櫟樹的培養(yǎng)基而言，通常需要選擇MS或WPN作為主要的培養(yǎng)基，莖端的初代培養(yǎng)與繼代增植培養(yǎng)需要采用同一類型的培養(yǎng)基，將BA細胞分裂素作為生長調(diào)節(jié)劑。如果采取胚胎培養(yǎng)方式，那么要在使用BA的基礎(chǔ)上，在其中添加其他營養(yǎng)物質(zhì)，促進胚胎快速萌發(fā)。例如：在櫟樹胚胎培養(yǎng)過程中，在MS培養(yǎng)基中加入0～7 μmol/L BA與0～7 μmol/L TDA，以此促進胚胎的健康發(fā)育。

2 體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)

2.1 誘導(dǎo)外植體 外植體是胚胎發(fā)生相關(guān)技術(shù)應(yīng)用的主要載體，合理選擇外植體，有助于提升胚胎的發(fā)生率。當前，在櫟樹繁育的過程中，主要采用合子胚及成熟的葉片制作外植體。例如，1989年相關(guān)報道中提出了采用合子胚制作外植體進行胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)，可以利用直接亦間接的方式，成功進行無性胚胎繁育，實現(xiàn)植株的再生。另外，還可以將營養(yǎng)器官作為外植體，選擇生長較為優(yōu)良的櫟樹，利用幼葉制作外植體，誘導(dǎo)胚胎的發(fā)生。在幼葉長度為0.5～1.5 cm時，對其進行采集，制作成為外植體，可進行胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)載體處理。

2.2 技術(shù)的應(yīng)用途徑 呂秀珍[1]研究表明，櫟樹體細胞的胚胎發(fā)生途徑主要包括間接類型與直接類型途徑，細胞起源可以分為單個及多個。對于直接類型的體細胞胚胎而言，源自胚胎發(fā)生的相關(guān)預(yù)決定細胞，其與胚胎的發(fā)生狀態(tài)較為接近，極易形成誘導(dǎo)作用，直接類型的方式多應(yīng)用在合子胚的相關(guān)組織培養(yǎng)工作中。例如，在合子胚相關(guān)幼葉的表面直接形成相關(guān)體細胞胚胎組織，可于WPM培養(yǎng)基中添加細胞分裂素，也可以添加0.5 μmol/L左右BA，這樣能直接誘導(dǎo)生成顏色為白色的體細胞胚胎。

間接類型的途徑，源自相關(guān)的胚性愈傷口組織細胞，在脫分化以后，可以將其作為誘導(dǎo)環(huán)節(jié)的決定性細胞成分。在誘導(dǎo)之前，于櫟樹愈傷組織中獲取體細胞胚胎，對其進行萌發(fā)處理。例如，在櫟樹葉子中導(dǎo)出愈傷胚胎組織，采用0.45 μmol/L 2，4—D，誘導(dǎo)率在67%左右，有助于成功誘導(dǎo)出體細胞胚胎。

2.3 成熟與同步化分析 完成誘導(dǎo)環(huán)節(jié)之后，為了達到同步化的最終目的，人們需要在成熟培養(yǎng)階段開展調(diào)控工作。而成熟培養(yǎng)有助于促使體細胞胚胎的良好發(fā)育，預(yù)防出現(xiàn)異常問題，提高萌發(fā)效果。在此期間，ABA屬于體細胞胚胎成熟方面的主要誘導(dǎo)激素，有助于促使單個胚胎的良好發(fā)育，預(yù)防畸形問題與裂生問題。劉清霞等[2]研究認為，外源ABA有助于促使胚胎快速成熟，不會影響其水分含量，可以提高其質(zhì)量，并預(yù)防萌發(fā)過程中出現(xiàn)畸形問題。當前有關(guān)研究中的體細胞胚胎發(fā)育系統(tǒng)存在一定差異，人們在某些培養(yǎng)基中會觀察到不同的培養(yǎng)體，筆者建議人們在體胚成熟階段針對性采用同步化的方式開展繁育工作。

2.4 體胚的具體萌發(fā)分析 當前，在櫟樹繁育體胚技術(shù)研究中，萌發(fā)率較低是體胚向幼苗轉(zhuǎn)變的主要抑制因素，這可能與內(nèi)源激素、組織發(fā)育特點存在直接聯(lián)系。在萌發(fā)階段IAA與ABA的使用數(shù)量與體胚的成熟有密切聯(lián)系，在內(nèi)源生長素使用劑量與細胞分裂素使用劑量較高的情況下，萌發(fā)效果會有所提升。

對于成熟的體胚而言，采用物理刺激法與化學(xué)刺激法，有助于提升櫟樹的萌發(fā)效率；利用干燥處理方式及復(fù)水處理方式，有助于打破櫟樹體胚中的胚軸休眠狀態(tài)，提高萌發(fā)效率。與此同時，外源類型的細胞分裂激素，有助于促使櫟樹體胚的萌發(fā)。研究可知，0.04～4.00 μmol/L BA，能使得櫟樹的體胚萌發(fā)，使得小植株生長出頂端部分，且TDZ在一定程度上可以增加櫟樹的體胚萌發(fā)數(shù)量，使其在成熟期間產(chǎn)生“饑餓感”，從而增加體胚的萌發(fā)數(shù)量，滿足櫟樹的繁殖工作需求。

3 結(jié)語

近年來，櫟樹的繁殖技術(shù)與相關(guān)育種技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，尤其在體胚繁殖方面，已經(jīng)經(jīng)歷了試管與體胚相關(guān)的繁殖階段，櫟樹的繁育速度得到提升，為造林工作的開展夯實了基礎(chǔ)。