SDF-1α/CXCR4信號促進骨髓間充質干細胞對海水吸入性肺損傷的治療作用

宋斯迪 魯 曦 金發光 梁 源 魚高樂

近年來，隨著海上活動的增加，海水淹溺事件呈逐年增多之勢，而肺臟是海水淹溺侵害損傷的首要器官[1]。海水進入肺內可迅速破壞肺泡上皮細胞屏障，導致肺組織屏障通透性增加，蛋白滲出至肺泡腔，引起肺間質和肺泡腔嚴重水腫，稱為海水吸入性肺損傷(seawater drowning induced acute lung injury, SWD-ALI)，表現為嚴重的呼吸困難和低氧血癥[2-4]。研究表明，海水吸入導致的肺損傷明顯比淡水嚴重，也更容易發展成為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，這與海水的高滲透壓、偏堿等理化性質有關[1]。ALI/ARDS是臨床常見的急重癥之一，發病機制尚未完全闡明，病情進展快，目前尚無十分有效的救治方法。

近來，干細胞領域取得的一系列研究進展使得干細胞治療ALI/ARDS成為可能。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是源于骨髓支持結構的成體干細胞，具有自我更新和多向分化潛能，且具有取材方便，免疫排斥反應弱等優點[5]。動物實驗顯示，BMMSCs能夠通過抑制炎癥、降低肺上皮細胞通透性等改善多種因素導致的急性肺損傷[6-8]。BMMSCs對肺損傷的修復需要其向肺組織的遷移歸巢、定植、分化[1]。然而，目前BMMSCs在肺損傷模型中的低定植率和低分化率仍然是其治療效果不佳的重要原因[2,9]。基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)及其受體CXC趨化因子受體4(CXCR4)在介導間充質干細胞定向遷移過程中發揮著關鍵作用[10]。本文通過觀察異體移植BMMSCs對海水吸入性肺損傷的治療作用，并觀察SWD-ALI模型中內源性SDF-1α和CXCR4表達變化，旨在明確SDF-1α對BMMSCs遷移及其對SWD-ALI治療效果的影響。

材料和方法

一、實驗材料

海水為中國國家海洋局第三海洋研究所提供的我國東南沿海海水，主要成分：滲透壓1 300 mOsm/L，pH 8.2，比重1.05，NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L。RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ購買于TaKaRa公司(日本)。AMD3100(MCE，美國)，SDF-1α(PeproTech，美國)，Transwell小室(Corning，美國)，CXCR4一抗(CST，美國)和SDF-1α一抗(Santa Cruz，美國)，CD29一抗(Santa Cruz)，HRP標記羊抗小鼠、羊抗兔二抗(碧云天，中國)。FBS和DMEM培養基購于Thermo公司(美國)。

二、實驗動物和分組

雄性SD大鼠(空軍軍醫大學實驗動物中心)40只，8～10周齡，200～220 g，SPF級，清潔級動物實驗室飼養，溫度18～26 ℃，相對濕度45%～70%，12 h/12 h光暗周期。SD大鼠隨機分為對照組(CON組)，海水吸入性肺損傷模型組(SW組)，海水吸入+BMMSCs治療組(SW+BMMSCs組)，海水吸入+BMMSCs治療+CXCR4阻斷組(SW+BMMSCs+ AMD3100組)，海水吸入+BMMSCs治療+SDF-1α給藥組(SW+BMMSCs+ SDF-1α組)，每組8只動物。所有動物實驗均依據空軍軍醫大學實驗動物操作規程執行，符合本單位動物實驗倫理道德規范。

三、實驗方法

1. 海水吸入性肺損傷模型建立和動物處理: 1.5%巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉大鼠，仰臥固定于動物手術臺，1 ml注射器插入氣管至隆突1.5～2 cm處，在20～30 min內勻速注入4 ml/kg海水。BMMSCs治療和CXCR4阻斷組大鼠分別于尾靜脈注射1×106個BMMSCs或AMD3100預處理的BMMSCs，24 h后造模。SDF-1α給藥組在造模海水中加入200 ng/ml的SDF-1α。各處理組在造模后4 h取肺組織樣本，進行后續檢測。

2. BMMSCs分離培養： SD大鼠用1.5%巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉后，頸椎脫位法處死，嚴格無菌條件下，取雙側股骨和脛骨，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用含1% FBS的DMEM培養基沖洗骨髓腔，收集骨髓細胞，反復吹打制成單細胞懸液，接種后置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，24 h后全量換液，后每3 d全量換液一次，待貼壁細胞達到80%～90%融合后，按1︰2比例傳代。倒置顯微鏡下觀察BMMSCs細胞形態，流式細胞儀檢測細胞表面標記物CD29。

3. Transwell遷移實驗： 將BMMSCs細胞(1×105個/ml)接種于Transwell小室上層，小室下層為含5% FBS的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h。使用AMD3100(10 μg/ml)37 ℃預處理BMMSCs細胞2 h阻斷CXCR4，下層培養基中分別加入0、100、150、200 ng/ml的SDF-1α。結束后，4%多聚甲醛固定Transwell 小室20 min，0.5%結晶紫染液染色5 min，在倒置顯微鏡下(200×)對遷移至微孔膜下層的細胞計數，每個樣本選取5個視野，取均數。

4. 肺組織HE染色： 1.5 %巴比妥鈉(2 ml/kg)麻醉后處死動物，取出肺臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后制成5 μm切片。脫蠟后進行常規蘇木素-伊紅(HE)染色，鏡檢。

5. Real-time PCR檢測： 使用RNAiso Plus試劑按照說明提取肺組織總RNA。Nanodrop 2000(Thermo，美國)測定RNA濃度后，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄為cDNA。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒，按照說明書，使用CFX96TMReal-time System(Bio-Rad，美國)進行Real-time PCR檢測。引物序列，見表1。

表1 real-time PCR引物序列

6. Western blot檢測： RIPA裂解液研磨裂解提取肺組織蛋白，4 ℃離心，取上清。8% SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA、80 min轉至PVDF膜。CXCR4一抗(1︰1 000)和SDF-1α一抗(1︰500)4 ℃孵育過夜。HRP標記羊抗小鼠、羊抗兔二抗(1︰1 000)室溫孵育1 h。化學發光經凝膠成像系統(Bio-Rad，美國)曝光檢測。

四、統計學方法

結 果

一、骨髓間充質干細胞觀察鑒定

光鏡下可見分離的BMMSCs貼壁生長，均勻分布，多數呈長梭形、卵圓形，少數呈三角形、多角形，表現為骨髓間充質干細胞的典型形態，見圖1A。流式細胞儀檢測顯示BMMSCs表面標志物CD29在絕大多數細胞呈強陽性表達，見圖1B、C。

二、SDF-1α/CXCR4信號對BMMSCs遷移的影響

Transwell實驗結果顯示，在下層培養基中添加SDF-1α可顯著增加穿過微孔膜的BMMSCs細胞數，并呈劑量反應關系。CXCR4阻斷劑AMD3100預處理BMMSCs，則顯著拮抗了SDF-1α對BMMSCs遷移的促進作用(&&)，但SDF-1α仍可部分促進AMD3100預處理的BMMSCs細胞遷移(##)，見圖2A、B。

三、海水吸入和BMMSCs治療對肺組織SDF-1α和CXCR4表達的影響

檢測海水損傷以及BMMSCs治療后肺組織本身SDF-1α和CXCR4的表達變化，結果顯示，海水吸入顯著提高了大鼠肺組織CXCR4和SDF-1α的mRNA水平。相比單純海水吸入損傷，BMMSCs治療可更進一步增加肺組織CXCR4和SDF-1α的mRNA表達，見圖3A、B。蛋白表達與mRNA表達表現出了相似的趨勢，海水損傷顯著提高了肺組織CXCR4和SDF-1α的蛋白含量，BMMSCs治療更進一步促進了CXCR4和SDF-1α的蛋白表達。但是，BMMSCs促進的mRNA和蛋白表達均被AMD3100預處理拮抗，見圖3C。

圖1 骨髓間充質干細胞鑒定；注：A：光鏡觀察骨髓間充質干細胞；B：流式細胞檢測IgG陰性對照；C：流式細胞檢測表面標志物CD29

四、CXCR4在BMMSCs治療海水吸入性肺損傷中的作用

HE病理染色顯示，見圖4A，海水吸入導致大鼠肺泡腔內嚴重的滲出、水腫和炎癥細胞浸潤，肺泡壁內也可見明顯的水腫和炎癥細胞。BMMSCs治療顯著減輕了海水吸入后肺泡腔和肺泡壁的滲出、水腫和炎癥細胞聚集。CXCR4阻斷劑AMD3100預處理BMMSCs，相較單純海水損傷組，雖然明顯改善了肺泡腔和肺泡壁的水腫和炎癥，但與BMMSCs治療組相比，表現為更嚴重的肺泡腔和肺泡壁的水腫、滲出和炎性細胞浸潤。與上述結果一致，海水吸入顯著增加了肺臟的濕干重比，BMMSCs治療可顯著降低海水吸入導致的肺濕干重比，而AMD3100則阻斷了BMMSCs的這一治療效應，見圖4B。

五、SDF-1α在BMMSCs治療海水吸入性肺損傷中的作用

與上述結果相似，海水吸入導致了嚴重的肺損傷(滲出、水腫、炎癥)，BMMSCs治療則可顯著減輕海水吸入引起的肺損傷。重要的是，BMMSCs治療合并肺部SDF-1α給藥，進一步減輕了海水吸入導致的肺損傷，見圖5A。同樣，合并SDF-1α肺部給藥，進一步促進了BMMSCs治療引起的肺濕干重比降低，見圖5B。

圖2 SDF-1α/CXCR4對骨髓間充質干細胞遷移的影響；注：A：Transwell微孔膜結晶紫染色；B：遷移BMMSC細胞數統計；*，**：P<0.05和0.01與“AMD3100(-)，SDF-1α (0)”組比較；##：P<0.01與“AMD3100(+)，SDF-1α (0)”組比較；&&：對應組比較P<0.01

圖3 海水吸入和BMMSCs治療對肺組織SDF-1α和CXCR4表達的影響；注：A：RealPCR海水吸入和BMMSCs治療對CXCR4 mRNA表達的影響； B：海水吸入和BMMSCs治療對SDF-1α mRNA表達的影響；C：Western blot檢測海水吸入和BMMSCs治療對CXCR4和SDF-1α蛋白表達的影響；*，**：P<0.05和0.01與對照相比；##：P<0.05與對應組相比

圖4 海水吸入和BMMSCs治療對肺組織病理和濕干重比的影響；注：A：海水吸入和BMMSCs治療后肺組織HE染色(×100)；B：海水吸入和BMMSCs治療后肺濕干重比統計； *，**：P<0.05和0.01與對照相比；#，##：P<0.05和0.01與對應組相比；n.s.：無統計學差異

圖5 SDF-1α對BMMSCs治療海水吸附性肺損傷的影響；注：A：BMMSCs及復合SDF-1α治療后肺組織HE染色(×100)；B：BMMSCs及復合SDF-1α治療后肺濕干重比統計； *，**：P<0.05和0.01與對照相比；#，##：P<0.05和0.01與對應組相比

討論

海水淹溺性肺損傷致病機理復雜，目前尚未完全闡明。研究認為，海水吸入后的多種致病因子，如海水高滲、高堿、破壞肺泡表面活性物質等損傷肺內皮細胞，引起炎癥失控，破壞肺泡/毛細血管屏障，導致肺泡和肺間質的滲出、水腫[1-11]。針對上述病因病理，目前治療方法主要集中于去除病因因素，同時對損傷的器官進行功能支持，以減少損傷的細胞數量和程度，如早期肺泡灌洗、機械通氣、補充肺泡表面活性物質、給予高壓氧療和激素等[1]。然而這些治療措施并不能有效的促進損傷細胞的修復，終止SWD-ALI病理進程，僅能部分改善臨床癥狀。

BMMSCs已經被多個實驗研究用于肺部損傷和疾病的治療，并取得了良好的效果。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的小鼠急性肺損傷模型中，靜脈注射BMMSCs可抑制肺炎癥因子釋放，減少肺組織膠原纖維，并可分化為Ⅰ型肺泡上皮細胞，綜合作用參與肺部損傷重塑[12]。在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary, COPD)動物模型中，BMMSCs通過抑制炎癥信號和炎癥因子釋放，并加強巨噬細胞吞噬功能，有效減輕COPD的肺損傷[13]。此外，BMMSCs還被研究用于治療、改善百草枯、缺血再灌注、輻射和支氣管發育不良等多種因素引起的肺損傷[14-17]。先前的一項研究顯示，在SWD-ALI中，BMMSCs可通過抑制肺部細胞自噬，減輕肺損傷程度[18]。與先前研究結果相一致，本文同樣表明，異體BMMSCs移植顯著減輕了SWD-ALI肺泡滲出、肺泡和肺泡間隔水腫、炎癥細胞浸潤，并降低了SWD-ALI肺組織的濕干比。這些結果表明，BMMSCs移植是SWD-ALI后一個潛在的有效治療措施。

BMMSCs在損傷肺部發揮修復作用需要BMMSCs向損傷肺部的遷移和定植[1-2]。然而，BMMSCs在肺損傷組織模型中的低遷移、移植率限制了BMMSCs對肺損傷的治療作用[19]。有研究表明，損傷肺組織能夠釋放多種趨化因子，并表達特異性受體或配體，引導趨化BMMSCs遷移并黏附于損傷部位[1]。在調控間充質干細胞定向遷移過程中，SDF-1α及其受體CXCR4被認為發揮關鍵作用[10]。本實驗研究發現，在SWD-ALI模型中，損傷肺組織中SDF-1α和CXCR4的基因和蛋白表達均明顯升高，表明SWD-ALI本身可一定程度啟動內源性BMMSCs的動員、遷移和定植。進一步使用CXCR4阻斷劑AMD3100預處理BMMSCs，顯著抑制了BMMSCs對SWD-ALI損傷的修復作用，表明SDF-1α/CXCR4信號參與了BMMSCs對SWD-ALI損傷的修復和治療過程。與本文相一致，先前的另一項研究也發現在BMMSCs高表達CXCR4，可顯著促進BMMSCs對百草枯導致的肺損傷的治療[20]。體外實驗顯示，SDF-1α可促進培養的BMMSCs遷移，而動物肺部給予SDF-1α進一步促進了BMMSCs對大鼠SWD-ALI的治療效果，從另一方面也證明SDF-1α/CXCR4信號在SWD-ALI模型中，可促進BMMSCs向損傷肺組織的遷移，并具有對肺組織的修復作用。

本研究結果表明，BMMSCs異體移植可有效改善和治療SWD-ALI。在此過程中，SDF-1α/CXCR4信號在促進BMMSCs向損傷肺組織遷移、定植和修復肺損傷的過程中發揮了重要作用。BMMSCs聯合肺部SDF-1α給藥可顯著促進其對SWD-ALI的治療效果。