薺菜生長素極性運輸基因1(CbPIN1)的克隆與表達分析

劉曉柱，李銀鳳

(貴州理工學院，貴州 貴陽 550003)

生長素(Auxin)是英國科學家達爾文(Darwin)父子發(fā)現(xiàn)的一種植物激素[1]。1928年荷蘭科學家溫特(Went)將其命名為生長素[2]。生長素在細胞水平調控細胞伸長、分裂與分化[3-6]；在植物個體水平，生長素調控器官建構、果實發(fā)育、植物衰老等多種生命過程[7-9]。生長素通過極性運輸實現(xiàn)在植物體內的差異分布[8]。

PIN家族是目前公認的一種生長素輸出載體，細胞膜上呈現(xiàn)極性分布，將生長素由細胞內運輸?shù)郊毎蚨{節(jié)著生長素濃度梯度的動態(tài)平衡[10-11]。PIN1、PIN2、PIN3、PIN4 、PIN7 等基因已先后從擬南芥或其他物種中分離出, 并發(fā)現(xiàn)這些基因參與調控器官建構、根的伸長、向地性、胚胎發(fā)育等過程[12-13]。

薺菜(Capsellabursa-pastoris)，十字花科草本植物，營養(yǎng)價值豐富，同時還具有較高的藥用價值，屬藥食同源植物[14]。另外，薺菜還是一種研究果實形態(tài)建成的模式植物。前期研究發(fā)現(xiàn)，生長素在薺菜心皮發(fā)育過程中起重要調控作用，同時生長素極性運輸基因PIN3在薺菜果實生長素的側向運輸中起著關鍵作用[15]。PIN1作為生長素極性運輸家族的重要一員，其在薺菜器官發(fā)育中的作用還未知。因此，筆者根據(jù)GenBank中擬南芥PIN1氨基酸序列，設計同源引物，通過RT-PCR技術，克隆了薺菜PIN1基因編碼區(qū)cDNA序列，并進行了序列生物信息學分析。同時，分析了PIN1在擬南芥原生質體中的定位以及在薺菜組織中的表達特性。此外，對PIN1蛋白進行了原核表達，還構建了植物過表達載體，獲得了轉基因植株，為進一步研究PIN1在薺菜器官發(fā)育中的作用奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試薺菜品種為野生型薺菜。供試擬南芥品種為Col-0，種子經(jīng)氯酸鈉表面消毒，無菌水沖洗后，鋪于MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化2 d，生化恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將幼苗轉移到基質中(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，生長條件為22 ℃，12 h/12 h光照/黑暗，培養(yǎng)21 d葉片用于制備原生質體。

大腸桿菌DH5α；質粒pSAT6-YFP、pBI121均由湖南農(nóng)業(yè)大學保存，PMD18-T載體購自TaKaRa公司。

甘油、瓊脂粉、各種抗生素、MS粉等購自上海生工生物有限公司；植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒、各種限制性內切酶、dNTPs、普通/高保真TaqDNA聚合酶、DNA連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 薺菜CbPIN1基因的克隆 嚴格按照試劑盒說明書提取薺菜葉片總RNA，甲醛變性膠電泳與核酸紫外分光光度計法分析檢測提取的RNA質量與濃度，然后采用反轉錄試劑盒將提取的總RNA反轉錄成cDNA。薺菜PIN1基因克隆引物的設計參考GenBank中擬南芥PIN1基因(NM_106017.4)序列進行(表1)。

將反轉錄的薺菜cDNA用于PCR反應，反應體系為：1 μL cDNA模板，2.5 μL PCR Buffer(10×)，1 μL dNTPs (10 μmol/L)，1 μLCbPIN1-C-F (10 μmol/L)，1 μLCbPIN1-C-R (10 μmol/L)，2 UTaqDNA聚合酶，補水至總體積25 μL。PCR反應程序為: 95 ℃，3 min; 94 ℃，1 min,55 ℃，1 min,72 ℃，2 min,35個循環(huán)；72 ℃，10 min。純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，連接至T載體后轉化至DH5α感受態(tài)細胞中，含IPTG和X-gal的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上篩選轉化子。試劑盒法小提白色克隆所含質粒，雙酶切法檢測并送測序進行分析。

1.2.2 薺菜CbPIN1生物信息學分析CbPIN1基因核酸序列同源性采用Blast法進行分析；CbPIN1開放閱讀框的查找和翻譯、氨基酸序列組成特點以及理化性質分析利用DNAStar軟件進行分析；CbPIN1蛋白結構特征采用蛋白質分析系統(tǒng)(http://www.expsy/ch/tools)進行分析；CbPIN1蛋白系統(tǒng)進化樹采用ClustalX 1.8與MEGA 5.0軟件進行構建。

1.2.3 薺菜CbPIN1亞細胞定位 擴增CbPIN1全長cDNA，PCR純化產(chǎn)物、pSAT6-YFP載體經(jīng)XhoⅠ和EcoRⅠ酶切后，進行連接反應，構建35Spro-CbPIN1-YFP重組分子。分離制備擬南芥葉片原生質體，PEG介導法將35Spro-CbPIN1-YFP導入原生質體中進行瞬時表達。激光共聚焦顯微鏡測定YFP熒光。引物序列見表1。

1.2.4 薺菜CbPIN1組織表達分析 分別提取薺菜根、莖、葉、花、種子部位總RNA并將其反轉錄成cDNA。β-actin為內參，實時熒光定量PCR(q-PCR)方法分析CbPIN1基因表達水平。采用Roche Lightcycler 480系統(tǒng)擴增CbPIN1基因。擴增體系：2 μL cDNA，0.8 μLCbPIN1-T-F，0.8 μLCbPIN1-T-R，10 μL SYBR Green Mix(2×)，補水至總體積20 μL。擴增程序：95 ℃，3 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，72 ℃，10 min。CbPIN1相對表達量的分析按照2-ΔΔCt方法進行。

1.2.5 薺菜PIN1蛋白原核表達 擴增CbPIN1全長cDNA，采用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切PCR純化產(chǎn)物和pMal-p2X載體，構建重組DNA分子pMal-p2X-CbPIN1。含重組DNA分子的大腸桿菌經(jīng) IPTG (1.0 mmol/L)誘導6 h后，SDS-PAGE檢測蛋白表達產(chǎn)物。

1.2.6 薺菜轉化pBI121-CbPIN1 擴增CbPIN1全長cDNA，Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切純化的PCR產(chǎn)物和載體pBI121，16 ℃過夜連接反應，連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含卡納霉素的LB培養(yǎng)基上，挑選抗性克隆，抽提質粒，雙酶切檢測后送測序。測序正確的重組質粒可用于后續(xù)植物轉基因研究。引物序列見表1。

構建好的重組載體pBI21-CbPIN1轉化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，菌落PCR檢測分析。當野生型薺菜主花序10 cm左右，次花序在蓮座開始形成時，剪掉已開花或將要開花的花苞，花絮浸漬法進行薺菜的遺傳轉化，轉化植物培養(yǎng)至種子成熟，收取轉基因薺菜種子進行下一步的篩選與檢測分析。

表1 所用引物Tab.1 Primers used

注：下劃線部分為酶切位點。

Note: The underlined characters were restriction enzyme cutting sites.

2 結果與分析

2.1 薺菜CbPIN1基因的克隆

提取21 d薺菜葉片總RNA并反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行RT-PCR反應，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得了一條約2 000 bp大小條帶(圖1)。純化PCR產(chǎn)物，進行序列測定，最終確定所克隆cDNA全長1 869 bp，C+G含量為49%。Blast比對結果顯示，所克隆序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)PIN1高度同源，相似性高達93%，與毛白楊(Populustomentosa)、碎米芥(Cardaminehirsuta)、金魚草(Antirrhinummajus)等植物中PIN1基因同源性均超過70%。因此，薺菜PIN1基因已被成功克隆，命名為CbPIN1，并提交至GenBank(登錄號：JN051352.1)。

M.1 kb plus DNA 分子質量標準；1-2.PCR擴增結果。M.1 kb plus DNA ladder; 1-2. Result of PCR.

2.2 薺菜CbPIN1蛋白結構分析

利用DNAStar軟件翻譯結果顯示，CbPIN1編碼的氨基酸個數(shù)為622(圖2)，蛋白分子量為67.05 ku，等電點為9.02。CbPIN1蛋白中包含49個堿性氨基酸(K、R)；42個酸性氨基酸(D、E)；241個疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)；157個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。在擬南芥中，生長素極性運輸功能的發(fā)揮依賴于PIN組分關鍵位點的磷酸化修飾。因此，NetPhosBac 1.0 Server 在線預測了CbPIN1蛋白是否存在磷酸化修飾，發(fā)現(xiàn)12個絲氨酸磷酸化位點，1個蘇氨酸磷酸化位點存在于CbPIN1蛋白中(圖3)，這暗示磷酸化修飾可能也會影響CbPIN1蛋白功能的發(fā)揮。

圖2 CbPIN1基因核苷酸序列及推測氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the CbPIN1

圖3 CbPIN1蛋白的磷酸化位點預測Fig.3 Phosphorylation prediction of CbPIN1 protein

蛋白質二級結構在線預測結果表明：CbPIN1蛋白無規(guī)卷曲(Random coil(c))為56.91%；β-折疊(Extended strand(e))為25.08%；α-螺旋(Alpha helix (h))為18.01%。ChloroP 1.1 Server預測結果顯示，CbPIN1蛋白信號肽切割位點在N端第1-73位氨基酸殘基之間，成熟蛋白質為549個氨基酸。TMHMM Server V.2.0 World Wide Web Server預測結果顯示，CbPIN1屬于跨膜蛋白，N端具有5個跨膜區(qū)，C端具有4個跨膜區(qū)(圖4)。

圖4 CbPIN1蛋白跨膜區(qū)預測Fig.4 Prediction of transmembrane domain of CbPIN1 protein

2.3 薺菜CbPIN1蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEAG 5.1構建了PIN1系統(tǒng)進化樹來分析CbPIN1蛋白的進化關系，發(fā)現(xiàn)在親緣關系上薺菜PIN1與擬南芥PIN1最近，同屬于進化樹上的一支；與菠蘿(Ananascomosus)PIN1(AcPIN1)親緣關系最遠(圖5)。

進一步分析表明，薺菜PIN1蛋白與擬南芥PIN1蛋白結構同源性超過90%，二者的N端和C端包含保守的跨膜結構域。此外， CbPIN1與AtPIN1親緣關系最近，屬于進化樹上的同一支；與AtPIN2關系也較近；與AtPIN6親緣關系最遠(圖6)。

圖5 CbPIN1蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis between CbPIN1 and other PIN1 proteins

2.4 薺菜CbPIN1亞細胞定位

首先，在線預測了CbPIN1亞細胞定位，結果顯示，CbPIN1在細胞膜上進行表達(圖7-A)。為進一步證實CbPIN1在細胞中的表達部位，構建了薺菜亞細胞定位載體35Spro-CbPIN1-YFP，PEG介導法將35Spro-CbPIN1-YFP載體轉化至擬南芥原生質體細胞中，發(fā)現(xiàn)擬南芥原生質體細胞膜上可檢測到YFP信號(圖 7-B-E)，進一步證明CbPIN1 定位于細胞膜。

圖6 PIN蛋白同源性分析Fig.6 Homologous analysis of PIN protein family

A.在線預測結果；B-E.原生質體瞬時表達結果(Bar=5 μm)。A.Prediction of subcellular location on line；B-E.Result of transient expression in the protoplasts (Bar=5 μm).

2.5 薺菜CbPIN1組織表達分析

為分析CbPIN1基因表達模式，q-PCR方法檢測CbPIN1在薺菜不同組織部位的表達情況。結果顯示，在薺菜根、莖、葉、花以及種子中CbPIN1基因均進行表達，但其表達量不同(圖8)。薺菜根中CbPIN1基因表達量最高，莖、花以及葉、種子中表達量均顯著低于根中的表達量。由此推測，CbPIN1可能參與調控薺菜在根、莖和葉的發(fā)育過程。

2.6 薺菜CbPIN1原核表達

為進一步分析CbPIN1蛋白表達情況，構建了原核表達載體pET-32a-CbPIN1，轉化至大腸桿菌。CbPIN1蛋白推測為67.05 ku。pET-32a載體自身tag序列大概20 ku，則表達出來的蛋白質大小應為87.05 ku。pET-32a-CbPIN1經(jīng)IPTG誘導，6 h后表達了預期蛋白條帶(圖9)。

2.7 薺菜過表達CbPIN1基因植株的獲得

為進一步研究CbPIN1對薺菜生長發(fā)育的影響，構建了植物過表達載體pBI121-CbPIN1。重組載體雙酶切反應，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可顯示出載體與目的基因2個片段，大小均符合預期，表明載體構建成功(圖10-A)。

圖柱上的不同字母表示不同組間差異顯著(P<0.05)。圖10同。Different letters above the columns indicated significant differences among the different groups at 0.05 levels.The same as Fig.10.

植物過表達載體pBI121-CbPIN1經(jīng)根癌農(nóng)桿菌介導法轉化野生型薺菜植株，經(jīng)卡納霉素檢測與分子檢測獲得了5株轉基因植株(圖10-B、C)。熒光定量PCR方法檢測其CbPIN1基因表達量，結果顯示，過表達植株中CbPIN1 基因表達量顯著增加(圖10-D)。

圖9 薺菜CbPIN1原核表達Fig.9 Prokaryotic expression of CbPIN1

A.pBI121-CbPIN1載體構建：1.空載體，2-3.重組載體雙酶切結果；B.轉基因植株卡納霉素篩選；C.轉基因植株分子檢測：CK. pBI121-CbPIN1載體，1-5.轉基因植株；D.熒光定量PCR檢測轉CbPIN1基因表達量。

A.Construction of plant expression vector pBI121-CbPIN1: 1.Empty vector, 2-3.Double restriction enzyme digestion of recombinant vector; B.Kanamycin screening of transgenetic seedlings; C.Molecular identification of transgenetic seedlings:CK.Plant expression vector pBI121-CbPIN1, 1-5. Transgenetic seedlings; D.DetectionCbPIN1 expression level using q-PCR method.

圖10pBI121-CbPIN1載體構建與薺菜轉基因植株的檢測
Fig.10ConstructionofplantexpressionvectorpBI121-CbPIN1andtransgeneticseedlingsidentification

3 結論與討論

生長素作為植物體內的一種重要激素，受到國內外學者的廣泛關注，而作為生長素運輸載體之一的PIN1，其自然也一直是植物學中研究的一個重點研究領域。在擬南芥、水稻、狗薔薇、蘋果、桑樹等多種草本、木本植物中先后均被克隆出來，也做了相應的功能分析，發(fā)現(xiàn)均參與生長素的運輸過程，調控植物根、果實等器官的發(fā)育過程。而薺菜作為一種藥食同源的植物，也可作為一種模式植物，但其PIN1基因一直未被克隆，且功能還未知，因此，本研究根據(jù)擬南芥PIN1蛋白序列，同源克隆了薺菜PIN1基因編碼區(qū)cDNA區(qū)域，結果發(fā)現(xiàn)，薺菜PIN1基因與擬南芥PIN1基因相似性高達93%。實質上，薺菜與擬南芥同屬十字花科，二者在遺傳背景和生理特性上都較為一致，因此，二者PIN1基因高度相似。另外CbPIN1與碎米芥(Cardaminehirsuta)、金魚草(Antirrhinummajus)等多種植物PIN1基因同源性也超過70%。說明植物中PIN1基因較為保守，暗示其功能可能較類似。為進一步證明其功能，采用生物信息學的方法分析了CbPIN1蛋白結構特點。發(fā)現(xiàn)CbPIN1是一個跨膜蛋白，亞細胞定位結果證實其在細胞膜上表達，這與其可能發(fā)揮生長素的運輸功能相一致。

Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中PIN蛋白在發(fā)揮生長素的極性運輸載體功能時，需要其特定結構域被磷酸化；Weller等[17]試驗結果進一步證實擬南芥特定TPRXS(N/S)模體(Motifs)位點的磷酸化是PIN1發(fā)揮生長素極性運輸?shù)谋匾疤?。因此，在線分析了CbPIN1磷酸化情況，結果表明，CbPIN1蛋白包含12個絲氨酸磷酸化位點，1個蘇氨酸磷酸化位點，這暗示磷酸化修飾可能也會影響CbPIN1蛋白功能的發(fā)揮。另外，進一步分析發(fā)現(xiàn)CbPIN1磷酸化位點分布特點與其他植物PIN1磷酸化位點分布較為一致。

越來越多的研究結果證實，PIN1在植物根(包括側根、側根原基、根尖等部位)的發(fā)育中發(fā)揮著重要的調控作用[18-20]。通過薺菜PIN1組織表達分析顯示，CbPIN1在薺菜根中表達水平最高，這暗示了CbPIN1也可能參與調控薺菜根的生長發(fā)育過程。此外，在莖、葉、花等部位CbPIN1也存在表達，但其表達量顯著低于根中的表達量，推測其CbPIN1基因可能參與調控這些器官的建構過程。

本研究通過同源克隆的方法獲得了CbPIN1 cDNA編碼區(qū)，生物信息學預測了蛋白結構特點；對CbPIN1進行了基因亞細胞定位、組織表達分析以及原核表達，另外，構建了植物過表達載體，獲得了轉基因薺菜，結果顯示，CbPIN1表達量均顯著增加。因此，本研究對薺菜PIN1基因做了初步分析，為進一步研究薺菜PIN1功能奠定了基礎，同時也豐富與完善了植物PIN1。