水稻膜聯蛋白基因OsAnn8干旱和低溫條件下表達模式以及CRISPR/Cas9定點編輯

卻志群，於紫蕾，沈春修

(宜春學院 生命科學與資源環境學院,江西省作物生長發育調控重點實驗室，江西 宜春 336000)

環境中的各種非生物脅迫會影響植物的正常生長和產量，由于全球異常氣候頻現和不適當的農業經營管理方法，非生物脅迫已經成為威脅全球農業生產和發展的一大挑戰。非生物脅迫對植物的傷害主要是通過使細胞內的平衡失調和細胞死亡的方式造成[1]。為了維持細胞內細胞結構和功能機制的穩定性，植物進化出一組相關基因，這些基因的表達可以幫助植物適應逆境環境，從而使植物可以在逆境條件下生存下來[2]。干旱和低溫脅迫是植物在生命周期中經常會遇到的脅迫壓力。迄今為止，已經發現了許多與干旱和低溫脅迫防御機制相關的基因，膜聯蛋白就是其中的一類，膜聯蛋白廣泛存在于動物、植物和微生物體內，最近，還有報道在原核生物里也發現了膜聯蛋白的存在，膜聯蛋白是一個超級基因家族，植物膜聯蛋白屬于家族D，其下面又被進一步分化成幾個亞基因家族[3-4]，在進化過程中，植物膜聯蛋白的結構和功能都變得越來越多樣化[3]。已經有報道，無論是在正常生長條件還是在脅迫環境條件下，膜聯蛋白在植物的生長發育過程中都發揮著重要作用[3, 5-7]。在擬南芥中首先鑒定到了第一個多基因膜聯蛋白家族，該家族有8個基因組成[3, 5, 8-14]，表達和功能分析證實它們是一個多功能的蛋白質家族。它們具有Ca2+結合、離子通道和過氧化物酶活性等不同的生物學功能，這些功能都是與植物生長發育和植物在脅迫條件下的反應緊密相關的[15]。已有報道在不同的脅迫條件下，植物膜聯蛋白的表達量會增強且會大量聚集在細胞膜上[16-19]。膜聯蛋白在細胞膜上的大量聚集可能與離子通道結構搭建，膜的保護以及ROS誘導信號等諸多功能相關。

雖然關于植物膜聯蛋白的研究已有不少報道，然而，有關水稻膜聯蛋白在非生物脅迫條件下的作用和相關機制的研究目前仍處于初級階段。Jami等[20]利用公共數據庫中公布的水稻基因組序列，通過與擬南芥中的膜聯蛋白基因進行同源序列比對，首次在水稻中鑒定發現10個膜聯蛋白基因家族成員。隨后，Qiao 等[18]通過RNAi和過表達的分析證實,水稻膜聯蛋白OsAnn1通過調控抗氧化物質的積累增強了水稻對干旱脅迫的耐受性。Shen等[21]通過CRISPR/CAS9介導基因編輯技術定點敲除了水稻OsAnn3位點，并進一步證實了T1敲除突變體植株的耐寒性相比耐冷野生型對照明顯減弱，說明水稻膜聯蛋白OsAnn3參與了水稻低溫脅迫條件下的耐冷性反應。

本研究以三-四葉期的耐冷粳稻TP309作為試驗材料，采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)技術對水稻膜聯蛋白基因家族成員之一的OsAnn8(LOC_Os09g20330)在低溫脅迫條件下和干旱處理條件下的表達模式進行分析，而后通過CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術對水稻膜聯蛋白基因OsAnn8的外顯子進行定點編輯，并成功地獲得了靶位點敲除的T0轉基因突變體植株。該研究為后續OsAnn8基因在干旱和低溫脅迫環境下的功能和作用機制研究奠定了重要的材料基礎。也證實了CRISPR/CAS9技術在水稻功能基因研究中應用的高效和易操作的特點。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料與處理 以水稻粳稻品種TP309作為轉基因受體和非生物脅迫處理試驗材料。在江西省作物生長發育調控重點實驗室中用無菌水及濾紙發芽，然后移栽到規格19.5 cm×14.5 cm×5.5 cm(長× 寬× 高)的盛有稻田泥土的塑料盒中，每盒種植3棵，種植于平均溫度約35 ℃的實驗室內，待正常生長至三-四葉期，選擇水稻苗長勢一致的2個盆分別用于干旱和低溫處理，其中一盆處理樣品停止灌溉直到泥土表面看不到水，開始進行土壤干旱脅迫處理，處理后72 h(3 d)和96 h(4 d)對水稻苗葉片進行取樣；將另一盆于4 ℃培養箱中進行24 h(1 d)、48 h(2 d)和72 h(3 d)的低溫處理。

1.1.2 載體與轉化菌株 本研究中，使用到的載體包括T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit，基因編輯克隆載體psgR-Cas9-Os和植物表達載體pSK51[21-22]，使用到的菌株有大腸桿菌菌株Trans5α和農桿菌菌株EHA105。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻材料RNA 提取 將TP309水稻幼苗在實驗室中常溫條件下培養至三-四葉期，分別取處理前和各階段處理的水稻葉片于液氮中研磨成粉，總RNA的提取按OMEGA公司E.Z.N.A? Total RNA KitⅡ試劑盒說明進行。

1.2.2 引物設計和cDNA第一鏈合成 參考Rice Genome Annotation Project Database (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 中公布的LOC_Os09g20330位點的cDNA序列設計熒光定量擴增引物OsAnn8-F和OsAnn8-R (表1)。引物序列由上海生工生物有限公司合成，使用試劑盒中的Oligo dT 作為反轉錄的3′端引物，然后根據TOYOBO公司的First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-(code no.FSK-100) 反轉錄試劑盒使用說明進行cDNA 第一鏈的合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.2.3 實時熒光定量PCR 在進行實時熒光定量PCR實驗之前，先進行退火溫度的梯度PCR擴增摸索調整引物擴增的特異性，選擇擴增特異性好的退火溫度在StepOnePlusTM熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增，通過計算ΔΔCt值的方法評估基因表達水平，泛素基因被使用作為本研究的內參，設置3個生物學重復和3次技術重復。反應體系為: 20 μL反應體系中加入2× SuperReal PreMix 10 μL，50×Ro×Reference Dye 1 μL，上游引物OsAnn8-F和下游引物OsAnn8-R各0.5 μL，RNase-free ddH2O 6 μL，模板cDNA 1 μL。反應條件為: 95 ℃ 10 min; 94 ℃變性15 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40個循環。

1.2.4 敲除靶位點的選擇、靶點接頭分子的設計及克隆 選擇位于靶基因外顯子PAM前的20個堿基作為靶位點，根據靶位點序列合成2條帶有接頭的寡聚靶點接頭分子OsAnn8-Oligo1和OsAnn8-Oligo2 (表1)，接頭分子的設計、復性和克隆參照沈春修[21-22]報道的方法進行。

1.2.5 目標基因的敲除靶位點突變檢測 參照目標基因OsAnn8靶位點側翼序列設計特異引物TB-OsAnn8F和TB-OsAnn8R，對野生型和轉基因植株目標基因的靶位點使用全式金pfu高保真酶進行PCR擴增并送樣測序。對靶位點測序檢測到堿基突變或者測序峰圖出現重疊峰的個體，再次對該個體的靶位點序列進行擴增并完成T載體大腸桿菌克隆，而后送4～6個克隆進行靶位點的測序，擴增反應程序為: 94 ℃ 5 min 預變性；94 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，進行35 個循環；72 ℃延伸11 min。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下水稻幼苗OsAnn8基因表達的熒光定量分析

以TP309幼苗葉片作為試驗材料，通過熒光定量PCR技術分析了水稻OsAnn8基因在不同干旱處理時間下的表達情況。結果如圖1 所示, 在干旱處理前,OsAnn8表達量較高, 干旱處理3 d后表達量出現大幅度下調，為處理前的0.08倍，當干旱處理4 d后，表達量較處理3 d后的水稻又有一定幅度回升，為處理前的0.14倍。OsAnn8基因在干旱脅迫處理前后表達量表現出高-低-高的變化規律。

柱形圖上方不同字母代表不同處理時間段差異顯著(P<0.05)。圖2同。Different letters donate significant difference (P<0.05) between different stress treats.The same as Fig.2.

2.2 冷脅迫處理下水稻幼苗OsAnn8基因表達的熒光定量分析

同樣以TP309幼苗葉片作為試驗材料，通過熒光定量PCR技術分析了OsAnn8基因在冷脅迫處理條件下的表達情況。結果如圖2 所示, 在冷脅迫處理之前,OsAnn8表達量較低, 冷脅迫處理1 d后表達量達到最高, 為處理前的48.4倍，冷脅迫處理2 d后表達量出現下調,但仍比處理前的表達水平高，為處理前的5.7倍，冷脅迫處理3 d后表達量繼續下調, 但還是比冷脅迫處理之前的表達量高，為處理前的1.7倍。OsAnn8基因在冷脅迫處理前后表達量呈現出低-高-低-低的變化規律。

圖2 水稻OsAnn8基因冷脅迫下表達分析Fig.2 Expression analysis of OsAnn8 in rice under cold stress

2.3 OsAnn8靶位點的基因編輯克隆載體構建

選擇在目標基因OsAnn8的第4外顯子序列上設計靶位點，將完成復性的OsAnn8的雙鏈靶點接頭與經BbsⅠ稀有內切酶酶切后的CRISPR/Cas9克隆載體psgR-Cas9-Os進行連接，轉化大腸桿菌后挑取單菌落進行陽性克隆鑒定，由于靶位點接頭只有20個堿基長度，不適宜進行插入片段的質粒酶切鑒定，本研究根據psgR-Cas9-Os載體sgRNA序列的上游存在的M13位點設計上游引物M13-F，而后與下游的其中一條寡聚靶點接頭分子OsAnn8-Oligo2一起通過菌液PCR進行陽性克隆的鑒定，結果發現挑取的4個單菌落克隆都擴增出了約250 bp大小的片段，此片段大小剛好與預期目的片段的大小相符，而以psgR-Cas9-Os空載體做模板的陰性對照沒有能夠擴增出相應目的條帶，表明目標基因OsAnn8靶位點的CRISPR/Cas9克隆載體Cas9-OsAnn8已經成功構建(圖3)，陽性克隆測序后的序列比對分析也證實了這一結果。

2.4 OsAnn8基因靶位點的CRISPR/Cas9植物表達載體構建

OsAnn8靶位點基因編輯植物表達載體的具體構建方法如圖4所示，首先使用快切限制性內切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切測序正確的OsAnn8靶位點的重組質粒Cas9-OsAnn8，1%的瓊脂糖凝膠上電泳分離后， 純化回收攜帶Cas9核酸剪切酶基因和引導RNA序列的5.6 kb DNA片斷，與經限制性內切酶酶切后同樣攜帶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ黏性末端的pSK51植物表達載體進行連接反應，熱激轉化大腸桿菌后涂板，15 h后挑取3個單菌落克隆搖菌，然后抽提質粒DNA，同樣使用上述2個限制性內切酶(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)進行質粒克隆的陽性鑒定，結果表明,3個單菌落克隆酶切后都出現了一條約11 kb的載體大片段和一條約5.6 kb的插入片段，說明OsAnn8的CRISPR/Cas9基因編輯植物表達載體pSK51-Cas9-OsAnn8已經成功構建(圖5)。

M.DL500; 1-4.陽性克隆; 5.空載體陰性對照。M.DL500 Marker; 1-4.Positive clones; 5.Negative control.

TAM.靶點接頭。TAM.Target adapter molecule.

M.DL15000分子標記; 1-3.pSK51-Cas9-OsAnn8陽性克隆。M.DL15000 Marker; 1-3.pSK51-Cas9-OsAnn8 positive clones.

2.5 T0轉基因植株目標基因靶位點序列突變檢測

通過農桿菌介導方法[23]轉化重組質粒pSK51-Cas9-OsAnn8進入到轉基因受體品種TP309，經過各個培養階段的潮霉素篩選后共獲得32株轉基因植株 (圖6)。使用目標基因OsAnn8第4外顯子上靶位點的側翼引物TB-OsAnn8F和TB-OsAnn8R (表1), 通過高保真DNA聚合酶PCR擴增T0轉基因植株靶位點序列，隨后送樣PCR產物測序進行突變檢測，結果發現，在32株T0轉基因植株的測序峰圖中，其中有2個單株出現了重疊峰 (圖7)，一個是T0-22(在PAM前第7個堿基開始出現重疊峰)，另一個單株是T0-31(在PAM前第4個堿基開始出現重疊峰)，序列比對結果也表明,只有這2個單株的靶位點序列與野生型相比發生了改變，說明本研究已獲得了目標基因OsAnn8靶位點成功編輯的2個突變體單株，緊接著2個突變體植株突變位點的PCR擴增產物被分別克隆到T載體上，各自隨機選擇4～6個陽性克隆送樣進行DNA測序。檢測到了2種不同類型的NHEJ(非同源端連接)突變：+1(1-bp插入)、-7(7-bp缺失) (圖8)，其中T0-22相比野生型水稻品種TP309缺失了緊連著PAM前的 7個堿基(CCAGCTA)，而T0-31與野生型水稻品種TP309相比在PAM前第4個堿基的位置上插入了1個堿基A, 但2個都是單等位突變體。

A.愈傷組織培養；B.pSK51-Cas9-OsAnn8農桿菌克隆與愈傷組織共培養；C.抗性愈傷組織篩選培養；D.抗性愈傷組織分化培養；E.轉基因植株生根煉苗。A.Callus culture; B.Co-culture of pSK51-Cas9-OsAnn8 agrobacterium clone and callus;C.The resistant callus culture;D.Resistant calli redifferentiation;E.Rooting of transgenic seedling.

PAM.前間區序列鄰近基序；WT.野生型。圖8同。PAM.Protospacer-adjacent motif；WT.Wild type.The same as Fig.8.

下劃線.靶序列。Underline.Target sequence.

3 結論與討論

膜聯蛋白是廣泛存在于動植物體內且通過鈣離子依賴方式與膜磷脂結合得一類蛋白家族，自從1978年從人類細胞中克隆出第一個膜聯蛋白以來[24]，目前已經陸續發現超過了1 000個膜聯蛋白亞家族成員，其中，人類基因組中發現了13 個膜聯蛋白亞家族成員，擬南芥基因組中發現了8 個基因家族成員[25]，水稻中也發現了10 個膜聯蛋白亞家族成員[20]，相比動物膜聯蛋白基因家族而言，在植物中，膜聯蛋白基因家族成員較少也比較簡單，而且基因功能和調節機制方面的研究都有待進一步深入。

水稻膜聯蛋白基因家族10個成員的編碼區彼此之間在核苷酸水平上具有45%～83%的序列同源性，在對應的氨基酸水平上也有16%～84%的序列一致性[20]。在植物中，在特定的條件下或特定的細胞類型中膜聯蛋白家族基因成員的表達水平經常會有不同。因此，盡管膜聯蛋白家族成員之間基因序列非常相似，但是植物膜聯蛋白家族中不同基因成員仍可能具有不同的功能。

OsAnn8基因是水稻膜聯蛋白基因家族成員之一，在Rice Genome Annotation Project (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml) 公共數據庫查詢顯示水稻膜聯蛋白OsAnn8基因全長1 543 bp，cDNA全長1 092 bp，共編碼363個氨基酸，包含4個外顯子組成。Jami等[20]通過對OsAnn8基因上游啟動子區域分析發現，該基因包含1個脅迫相關的順式作用元件DRE/CRT (C-repeat/Drought responsive element)(G/ACCGCC)，而DRE/CRT是植物耐冷調控轉錄因子CBFs(C-REPEAT BINDING FACTORS)對冷反應相關基因進行轉錄調節的結合位點，調節基因CBF的表達蛋白通過結合到下游結構基因啟動子上的CRT/DRE序列元件上, 從而誘導CBF作用的下游結構基因的表達, 使植物的耐寒性提高[26]，這表明OsAnn8有可能作為CBF轉錄因子調控的下游基因參與水稻對冷脅迫條件的響應。

在本研究中2種非生物脅迫環境下，OsAnn8基因對干旱和低溫處理都做出了響應，在干旱處理3,4 d后表達量分別下降為處理前的0.08倍和0.14倍。說明OsAnn8基因可能通過負調控的方式參與了水稻對干旱脅迫的響應。然而，OsAnn8基因在冷脅迫處理1，2，3 d后，其表達量則表現出上調，尤其是4 ℃剛處理1 d后的表達量達到最大，為處理前的48.4倍。這說明OsAnn8基因可能主要是在水稻遭受冷脅迫環境后24 h左右起作用，通過大幅度提高表達量以正調控的方式參與水稻對低溫脅迫的響應，幫助水稻抵御冷脅迫條件。盡管水稻OsAnn8基因對干旱和低溫脅迫都作出了響應，但卻有所不同，OsAnn8基因對干旱脅迫做出了下調表達的響應，而在低溫脅迫處理后卻做出了上調表達的響應，這可能是因為水稻OsAnn8基因通過不同的調節機制參與了水稻對干旱和低溫脅迫的響應。

利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，本研究成功獲得了水稻OsAnn8基因位點的2個單等位突變體，下一步將在2個T0單等位突變體完成自交后，在T1中各自分別篩選出部分OsAnn8基因位點的雙等位突變體與野生型水稻品種TP309一起用于干旱和低溫脅迫處理后的表型鑒定比較分析，因此，本研究為OsAnn8基因在干旱和低溫脅迫環境下的功能和作用機理研究提供了重要的突變體材料，對解析水稻OsAnn8基因在逆境脅迫條件下的生物學功能具有重要意義。

本研究通過對水稻膜聯蛋白基因家族成員OsAnn8在干旱和低溫脅迫條件下表達水平的熒光定量分析，證實OsAnn8參與了水稻對干旱和低溫脅迫的應答，初步了解了OsAnn8在干旱和低溫脅迫條件下的表達模式及規律。本研究進一步利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，成功獲得了水稻OsAnn8基因位點的2個突變體，為OsAnn8基因在非生物脅迫環境下的功能和作用機制研究提供了重要的材料基礎，對解析水稻OsAnn8基因在非生物脅迫條件下的生物學功能具有重要意義。