復合酶-間歇超聲法制備玉米多孔淀粉工藝

蔣新龍 蔣益花 王純潔 朱志友 金文浩 沈佳琦

(浙江樹人大學生物與環境工程學院，杭州 310015)

我國玉米年產量及進出口量大，產業發展迅速，規模經濟總量大，對玉米進行多層次深度加工已成為玉米產業的主要發展方向[1-3]。多孔淀粉是由玉米淀粉經處理而使顆粒呈現多孔狀，與天然淀粉相比，具有較大的比表面積， 較低的顆粒密度及良好的吸水、吸油、分散等優良性能[4-7]，可用于食品色素、香料、酶制劑、維生素、糖果、油脂、調味料、粉末食品等產品中，應用價值很高[8-10]。利用玉米淀粉制備多孔淀粉是提高玉米使用價值和經濟效益的有效途徑。

多孔淀粉的制備有許多方法，如機械方法，物理方法和生化方法[4-6,11]。酶解法由于所用酶制劑價格低廉、使用方便、制備過程簡單、目的性強，被認為是最具應用價值的方法之一[12-14]。糖化酶和α-淀粉酶是最常用的兩種酶，它們的復合協同作用，能有效提高多孔淀粉的生成質量[4-5,15-16]。 超聲波能降解淀粉大分子，一定強度的超聲波有利于提高纖維素酶、蛋白酶、糖化酶、糖苷酶等酶的活性。酶解過程間歇超聲處理有利淀粉顆粒的開孔效果[17]。間歇超聲波輔助糖化酶制備多孔淀粉及復合酶-超聲波輔助法制備馬鈴薯多孔淀粉已有報道[18]，但復合酶-間歇超聲法制備玉米多孔淀粉工藝鮮有報道。

本研究以玉米淀粉為實驗材料，采用吸附率作為評定多孔淀粉優劣的指標，采用Plackett-Burman設計法篩選影響復合酶-間歇超聲法制備多孔淀粉的主要因素，并利用Box-Behnken響應面分析法對主要因素進行優化得出最佳制備工藝，為進一步開發利用玉米淀粉提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉；α-淀粉酶、糖化酶，根據GB 8275—2009方法測定α-淀粉酶酶活[19]，測得α-淀粉酶酶活為1 698 IU/mL，根據GB 8276—2006方法測定糖化酶酶活[20]，測得糖化酶酶活為1.19×104IU/g；所用試劑均為分析純；所用水為蒸餾水。

UV-9100紫外可見光譜儀；pHS-3B型精密pH計；ZHWY-110X 往復式水浴恒溫培養振蕩器；CQ-250S臺式超聲波清洗器(250 W，40 kHz)；HitachiS-4700場發射掃描電子顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 多孔淀粉的制備

向250 mL錐形瓶中加入適量的玉米淀粉和一定pH值的緩沖溶液(緩沖溶液由檸檬酸和磷酸氫二鈉預先配制)，制成不同質量濃度的淀粉乳。將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器上預熱一定時間，通過水浴控制體系溫度。然后，向其中加入一定量的糖化酶和酶α-淀粉酶，在合適的反應溫度下，經過一定的酶解反應時間。其中，在酶解過程中進行間歇超聲處理，每30 min處理1次(如需處理10 min，則每酶解29 min處理1 min，5 h酶解結束時共處理10 min，以此類推)。酶解結束后立即加入質量濃度為4%的NaOH溶液5 mL終止反應。隨后，用蒸餾水洗至中性并抽濾，然后干燥(60 ℃，常壓)、粉碎、過100目篩，即得多孔淀粉。

1.2.2 多孔淀粉吸附率的測定

多孔淀粉的吸附屬于物理吸附，沒有選擇性，多孔淀粉的吸附性能可以通過吸附率進行表征[5]。由于甲基紫溶液在583 min處有最大吸收[5]，且吸收值與其含量呈線性關系，本研究采用甲基紫溶液作為待吸附的物質，對產物的吸附率進行測定。

稱取1 g多孔淀粉樣品，置于250 mL的錐形瓶中，向其中加入0.1 g/L的甲基紫溶液100 mL，在水浴恒溫振蕩器中振蕩5 h，設置溫度25 ℃，轉速120 r/min，然后用離心機以1 5000 r/min的轉速離心8 min，分離上層清液。取2 mL上層清液加入到10 mL比色管中，定容到10 mL。用紫外可見分光光度計在583 nm處測其吸光度。重復3次。

準確配制甲基紫標準系列溶液(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L)，蒸餾水為空白樣，在583 nm處測其吸光度A。以甲基紫的濃度C為橫坐標，吸光值A為縱坐標繪制甲基紫的標準曲線。實驗得到甲基紫濃度在1.0 mg/L到5.0 mg/L之間的標準曲線方程為：A=0.087 3c-0.028 5；R=0.999 1。根據標準曲線計算甲基紫濃度，吸附率Y按公式計算：

式中：C0為甲基紫溶液初始質量濃度/mg/L；Ce為吸附平衡時溶液中甲基紫質量濃度/mg/L 。

1.2.3 單因素實驗

以對甲基紫吸附率為指標，考察9個影響吸附率的因素，得出單因素對吸附率的變化規律，并確定9個單因素的最佳值。單因素實驗采用的固定參數分別為：水浴加熱預處理15 min，底物淀粉濃度 33.33%、酶用量1.2%、酶配比(糖化酶∶α-淀粉酶)9∶1、pH 5.0，反應溫度 55 ℃、反應時間5 h，超聲功率250W，超聲時間30 min。分別固定其中的8個因素，變化另1個因素進行優化，因素變化范圍分別為：預處理時間(5～30 min)、pH(4.0～6.5)、超聲功率(125～250 W)、酶用量(0.4%～2.4%)、酶配比(9∶1～1∶9)、反應溫度(40～65 ℃)、超聲時間(10～60 min)、底物濃度(9.09%～33.33%)、反應時間(2～10 h)。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設計

在單因素實驗基礎上，利用Plackett-Burman實驗設計法，除了單因子即可篩出結果的3個影響因素(水浴加熱預處理時間、超聲功率和淀粉濃度)外，對其他6個影響因素中篩選出主效應因素。每個因素分別取低(-1)和高(+1)兩個水平，共12個實驗組合。具體設計見表1。每個處理重復3次，取平均值為實驗結果。

表1 Plackett-Burman 設計因子水平

1.2.5 Box-Behnken實驗設計

在Plackett-Burman實驗基礎上，采用響應面Design-Expert.V.8.0.5軟件中Box-Behnken模型進行實驗設計，對多孔淀粉制備工藝參數中的主效應因素酶用量、反應時間和超聲時間進行優化分析得二階響應面模型，確定最優制備多孔淀粉條件并進行驗證，具體設計見表2。

表2 響應面分析因素與水平

1.2.6 多孔淀粉微觀形態分析(掃描電鏡法)

將淀粉樣品用導電雙面膠固定到金屬載物臺上，使用真空鍍膜儀噴鍍鈀金，然后在15.0 kV電子束條件下對樣品進行掃描電鏡觀察。

1.3 數據處理

顯著性檢驗采用Duncan法；響應面優化法采用Design-Expert.V.8.0.5軟件進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 預處理時間對甲基紫吸附率的影響

采用原淀粉的預糊化方法進行預處理。在預糊化過程中，利用水分子破壞淀粉分子間氫鍵，破壞了規律排列的膠束結構，有利于酶液進入淀粉顆粒內部反應，增加酶作用位點，從而可加快酶反應效率[21]。圖1表明，隨著預處理時間的增加，吸附率呈現先增后降的過程，輕度糊化有利于酶在淀粉顆粒上作用，預熱時間短，所增加酶作用位點不足，吸附率較低；預熱15 min所制的吸附率最高；預熱時間超過15 min，糊化程度大的淀粉被過度酶解生成葡萄糖，淀粉顆粒面臨崩潰，形成孔穴效果變差[22]。綜合考慮所制的多孔淀粉的吸附率、時間成本及能耗，預熱15 min作為后續實驗條件。

圖1 不同處理對甲基紫吸附率的影響

2.1.2 pH對甲基紫吸附率的影響

糖化酶和α-淀粉酶的最適 pH 分別是 4.2 和 5.0[23]。在酶解反應過程中，只有兩種酶協同作用效果才最明顯，一種酶活性太高，而另一種酶活力過低都不利于多孔淀粉的形成。圖1表明，隨著pH的增大，吸附率呈現先增后降的過程，反應體系 pH 為 5.0 時，兩種酶的活性相對適中，協同作用最為明顯，吸附率最高，且淀粉顆粒不會被過度分解。

2.1.3 超聲功率對甲基紫吸附率的影響

超聲波是一種彈性機械波，能破壞溶液中多糖的C—C鍵，降低多糖的相對分子質量，促進或者抑制酶活。一定強度的超聲波有利于提高纖維素酶、蛋白酶、糖化酶、糖苷酶等酶的活性；高強度的超聲波會破壞酶的微觀結構，降低酶活性[17]。圖1表明，超聲功率250 W時所制的多孔淀粉吸附率最高，而且與其他水平之間差異皆顯著(P<0.05)。考慮所制的多孔淀粉的吸附率和超聲功率水平設置，選擇超聲功率250 W為后續的實驗條件。

2.1.4 酶用量對甲基紫吸附率的影響

圖1表明隨著酶加入總量的增加，吸附率呈現先增后降的過程，酶用量1.2%時吸附率最高。這是因為當酶用量過低時，只有部分淀粉顆粒可以有效地接觸到酶分子，隨著酶用量的增加，酶-底物復合物也隨著增加，但酶濃度增加過多，會引起淀粉顆粒的過度水解，起到相反效果[24]。因此對于整個系統，酶用量 1.2%為最佳，此時酶解反應充分且不會過度，產物多孔淀粉的吸附率最高，吸附效果最佳。

2.1.5 酶配比對甲基紫吸附率的影響

糖化酶是外切作用酶，從淀粉的非還原端水解 α-1，4-糖苷鍵，又能水解α-1，6-糖苷鍵；α-淀粉酶是內切作用酶，隨機攻擊淀粉顆粒內部的 α-1,4-糖苷鍵[15]。兩種酶的協作不僅提高了水解率，而且還提供了更為有效的水解點，使酶解作用逐步深入到顆粒內部，在中心附近熔融，形成中空結構[16]。圖1表明，當糖化酶與α-淀粉酶的比例為9∶1時，這種協作效果最明顯，此時淀粉水解度最佳，淀粉顆粒的開孔效果最好，吸附率也最高。

2.1.6 反應溫度對甲基紫吸附率的影響

糖化酶和α-淀粉酶最佳反應溫度為分別為58～65 ℃和75 ℃[23]。圖1表明，隨著反應溫度的升高，吸附率呈現先增后降的過程，50 ℃時多孔淀粉的吸附率最高。反應溫度過低，糖化酶和α-淀粉酶的催化效能未得到充分發揮。50 ℃反應體系雖然不是在復合酶水解的最佳溫度，酶的活性不是最高，但酶活力保持的時間較長。因此，選擇50 ℃的反應溫度。

2.1.7 超聲時間對甲基紫吸附率的影響

圖1表明，當酶解過程處于最高超聲功率250 W，隨著超聲時間的延長，吸附率呈現先增后降的趨勢，超聲時間為20 min時所制的多孔淀粉吸附率最高。這是因為超聲波利用彈性機械波能降解淀粉大分子，促進或者抑制酶活。一定強度一定超聲時間的超聲波有利于提高酶活。較高強度的超聲波超聲時間過長，可使酶中氫鍵(維持酶一級結構的穩定)斷裂，導致蛋白質結構的展開；超聲作用產生的OH-有很強的氧化作用，能與酶中的氨基酸結合反應[25]。當較高強度較長時間超聲對反應體系的負效應大于正效應時，多孔淀粉的水解率下降。

2.1.8 底物濃度對甲基紫吸附率的影響

從圖1中發現，隨著底物淀粉濃度的增加，吸附率也隨著上升。但隨著底物淀粉濃度的增加，其黏度的增幅也急劇變大，當淀粉乳濃度至33.33%或以上，“淀粉乳”已成為團漿狀。在此狀態下，攪拌阻力大，反應過程中攪拌不均勻，導致反應體系不穩定；同時反應體系中的自由水的濃度降低，抑制了酶和底物的反應。故淀粉乳濃度以33.33%為宜。綜合考慮所制多孔淀粉的吸附率、底物濃度水平設置及實驗操作的便利性，淀粉乳濃度33.33%為后續的實驗條件。

2.1.9 反應時間對甲基紫吸附率的影響

圖1表明，隨著反應時間的延長，吸附率先增后降，8 h 反應時間對應的多孔淀粉吸附率最高，吸附效果最好。在開始階段隨著酶解反應的進行，淀粉顆粒表面的孔越多、越深、越大，其吸附能力越高；但反應時間超過8 h，酶水解過度，顆粒淀粉的完整結構被損壞，使得產物的吸附能力一步步降低直至消失[24]。因此，選擇 8 h 作為酶解反應的最佳時間條件。

2.2 Plackett-Burman篩選實驗

Plackett-Burman(PB)實驗為篩選實驗設計，主要針對因子數較多，且未確定眾因子相對于響應變量的顯著性而采用的實驗設計方法。篩選實驗設計雖不能區分主效應與交互作用的影響，但可分清實驗因素對指標影響的大小，從眾多的考察因素中盡快而有效地篩選出最為重要的幾個因素，避免在后期的優化實驗中由于因子數太多或部分因子不顯著而浪費實驗資源[26-28]。

本研究選用了實驗次數N=12的Plackett-Burman實驗設計，根據單因子實驗，水浴加熱預處理15 min、超聲功率250 W、和淀粉濃度33.33%作為固定條件，其他6個因素通過Plackett-Burman實驗設計進行篩選，以吸附率為響應值，實驗結果見表3。由方差分析表4可以看出，對制備多孔淀粉的影響重要性依次為：反應時間(E)，超聲時間(F)，酶用量(B)，pH(A)，反應溫度(D)，酶配比(C)。其中，E、F、B的P值小于0.10，說明其對多孔淀粉的制備影響比較顯著，為最為明顯因素。

表3 Plackett-Burman實驗設計結果

表4 方差分析

2.3 響應面優化實驗

響應面分析法是一種優化多變量系統的有效實驗工具[26-28]。根據單因子實驗和Plackett-Burman篩選實驗結果，反應時間、超聲時間、酶用量三個因素作為主效應因素，選用Box-Behnken Design(BBD)實驗設計，以對甲基紫吸附率為響應值，做3因素3水平共 17個實驗點(5個中心點)的響應面分析實驗，實驗結果見表5。

表5 響應面實驗設計與結果

固定實驗條件：水浴加熱預處理15 min，超聲功率250 W，淀粉濃度33.33%，pH 5.0，酶配比(糖化酶∶α-淀粉酶)為9∶1，反應溫度 50 ℃。

2.3.1 方差分析

采用Designexpert程序對所得數據進行回歸分析，回歸分析結果見表6。從表6中可以看出，反應時間(B)和超聲時間(C)的P值都小于0.01，說明二個因素對多孔淀粉的制備影響都極顯著。方差分析說明各個實驗因子對多孔淀粉的制備影響由大到小的順序依次為：反應時間(B)、超聲時間(C)、酶用量(A)。方差分析也說明各個具體實驗因子與響應值都不是簡單的線性關系。

表6 回歸方程方差分析結果

2.3.2 擬合模型的建立

對響應面測試數據進行回歸擬合，確立回歸方程：

吸附率Y/%=+60.03+0.14A+0.84B+0.74C-0.99AB-0.47AC+0.41BC+0.039A2+0.014B2-0.80C2

由表6可知，整體回歸模型具有顯著性(P<0.05) ，失擬項檢驗的P=0.322 9(不顯著)，表明模型充分擬合實驗數據，該方程是多孔淀粉的制備工藝參數的合適數學模型，可以用此模型對多孔淀粉制備工藝進行分析和預測。變異系數CV反映了模型的置信度，CV值越低，說明模型的置信度越高[29]。本實驗的CV 值為0.94%，表明置信度較高，模型方程能夠較好地反應真實實驗值，可用此模型分析響應值的變化[30]。

2.3.3 交互作用分析

在酶用量、反應時間、超聲時間3個因素中任取兩個作為X和Y，以對甲基紫吸附率作為Z，由Design-Expert.V 8.0軟件處理作出相應的各因素交互作用的三維曲面圖。表現為曲線越陡，說明交互作用對甲基紫吸附率的影響越顯著。甲基紫吸附率隨任意兩個變量的增加都呈現上升趨勢，達到某一極大值后，曲面下降或趨向于平緩，且酶用量(A)和反應時間(B)的交互作用對甲基紫吸附率影響最顯著，這與回歸分析的結果吻合。

2.3.4 最優工藝驗證

利用軟件繪出回歸模型的等值線，并確定模型的極大值點，預測所得多孔淀粉對甲基紫的最大吸附率為62.60%。利用軟件得出反應時間10 h、超聲時間29.83 min和0.4%酶用量為最佳。綜合分析可得多孔淀粉制備的最優條件：水浴加熱預處理15 min，超聲功率250 W，淀粉濃度33.33%，pH 5.0，酶配比(糖化酶∶α-淀粉酶)為9∶1，反應溫度50 ℃，酶用量0.4%(相當酶活力10.87 IU/g)，反應時間10 h，超聲時間29.83 min。按照優化后的最優條件進行驗證實驗，實測對甲基紫吸附率達到62.42%，與預測值62.60%無顯著差異，表明了PB和BBD方法聯用的可行性，也證明了該套統計學實驗設計與分析方法在多孔淀粉加工應用中的準確性和可靠性。同一吸附條件下，測得原淀粉對甲基紫吸附率為22.42%。復合酶-間歇超聲法制備多孔淀粉，操作簡單，反應時間短，生產成本低，且所得多孔淀粉對甲基紫的最大吸附率是原淀粉的 2.8倍，說明復合酶-間歇超聲法是很有前景的制備多孔淀粉的好方法。

圖2 玉米淀粉SEM圖

2.4 多孔淀粉的微觀形態分析

圖2為原玉米淀粉的SEM照片，玉米原淀粉的顆粒外形為不規則多邊形，顆粒表面具有一些比較平緩的棱角，孔數極少。圖3為經由復合酶-間歇超聲法制備的多孔淀粉，淀粉顆粒表面形成了多孔結構，分布于整個顆粒表面，并且孔的孔徑較大、深度較深，表明多孔淀粉成孔較好，比表面積增大。從理論上分析，糖化酶和α-淀粉酶這兩種酶的協同作用使水解向淀粉分子內部推進，一定強度的超聲波輔助作用有利于酶解制備的多孔淀粉吸附率的提高及其比表面積的增大，宏觀的效果就是淀粉顆粒表面形成獨特的多孔結構。

圖3 多孔淀粉SEM圖

3 結論

以玉米淀粉為原料，通過酶解單因素實驗、Plackett-Burman(PB)篩選實驗和Box-Behnken Design(BBD)響應面實驗設計對復合酶-間歇超聲法制備多孔淀粉工藝進行優化。結果顯示，對多孔淀粉的制備影響由大到小依次為：反應時間，超聲時間，酶配比。制備玉米多孔淀粉最適條件為：水浴加熱預處理15 min，底物淀粉濃度 33.33%、超聲功率250 W，超聲時間29.83 min，酶用量 0.4%(相當酶活力：10.87IU/g)、酶配比(糖化酶∶α-淀粉酶)9 ∶1、pH 5.0，反應溫度 50 ℃、反應時間 10 h，實測吸附率為62.42%，接近理論預測值62.60%，是原淀粉對甲基紫吸附率的 2.8倍。電鏡微觀形態分析表明：多孔淀粉微孔的吸附率變化與其微觀結構變化相吻合。本實驗證實了PB和BBD方法聯用在多孔淀粉加工應用的可行性和復合酶-間歇超聲法制備多孔淀粉應用性。